光致细胞硬化：荧光显微镜下被忽视的快速力学效应及其在光毒性评估中的应用

《Cell Reports Physical Science》：Stiffening cells with light

本研究针对荧光显微镜观测活细胞时引发光毒性、导致细胞行为改变这一长期难题，开展了一项关于“光致细胞硬化”现象的系统性研究。研究人员通过微压痕技术等多种力学测量方法，证实多种荧光探针（如Fluo-4、DCFH-DA）的激发可在数秒内引起多种细胞类型（T细胞、内皮细胞等）发生剂量依赖性的快速硬化，该效应与活性氧（ROS）产生密切相关，且不依赖于肌动蛋白细胞骨架的完整性。这项研究不仅揭示了光诱导细胞硬化的普遍机制，更重要的是提出将细胞刚度变化作为定量评估光毒性的新方法，对优化活细胞成像实验方案及评估光动力疗法效率具有重要意义。

　　

在生命科学研究中，荧光显微镜如同科学家观察细胞内部动态的“眼睛”，它通过让特定的分子发出荧光，帮助研究人员揭示生命过程的奥秘。然而，这双“眼睛”在带来光明的同时，也可能无意中伤害它正在观察的对象——活细胞。这种伤害被称为光毒性，其主要元凶是光激发过程中产生的活性氧（ROS）。这些高活性分子能像不听话的“破坏分子”一样，氧化细胞内的蛋白质、核酸等关键成分，甚至引发蛋白质之间的异常交联，从而干扰细胞的正常功能。更令人担忧的是，许多研究人员虽然意识到光毒性的存在，却缺乏快速、定量评估其影响的有效手段。传统的评估方法，如观察细胞周期进程或增殖能力，往往需要数小时甚至数天，且对低光强度下的即时效应不敏感。因此，开发一种能够实时、定量反映光毒性影响的新方法，成为了该领域亟待解决的关键问题。

这项发表在《Cell Reports Physical Science》上的研究，源于一个偶然的观察。研究人员在利用钙离子探针Fl_uo-4观察T细胞活化过程时，发现一旦开启蓝色激发光，原本活跃地伸出伪足的T细胞竟然在几秒钟内就“僵住”不动了，仿佛被瞬间冻结。这一反常现象促使研究团队追问：光的照射是否不仅影响细胞的行为，更会迅速改变其最基本的物理性质——力学特性？是让细胞变软，还是变硬？

为了回答这些问题，Eva Gonzalez、Jana El Husseiny等研究人员开展了一系列精细的实验。他们采用了一种创新的“轮廓微压痕”技术，能够像用微小的“手指”轻轻按压单个细胞，并精确测量其抵抗变形的能力，即细胞刚度。研究人员设计了严谨的实验方案：先测量细胞在黑暗中的基础刚度，然后给予一定剂量的光照射，再次测量其刚度变化，从而直接评估光照射的即时效应。

研究发现，光致细胞硬化是一个普遍、快速且强烈的现象。当负载不同荧光探针（如Fl_uo-4、用于检测ROS的DCFH-DA、用于细胞核染色的Hoechst等）的T细胞、中性粒细胞样PLB-985细胞或牛主动脉内皮细胞（BAECs）被相应波长的光（蓝光或紫外线）照射后，它们的刚度在短短10秒内显著增加，增幅可达数倍至十倍之多。这种硬化效应是剂量依赖性的，即光照越强、时间越长，细胞变得越硬。更重要的是，这种硬化在光照后至少能持续1.5小时，表明其影响是持久的。

研究人员进一步探究了其背后的机制。他们使用DCFH-DA作为ROS的“报告分子”，发现随着光照时间的积累，细胞内的ROS水平迅速升高，并与细胞刚度的增加呈现出明显的正相关。为了确认ROS的关键作用，研究团队进行了“反向验证”：他们不依赖光照，而是直接让细胞接触过氧化氢（H₂O₂，一种常见的ROS），结果同样观察到了显著的细胞硬化。此外，他们使用光动力疗法（PDT）中常用的光敏剂——脱镁叶绿酸a（Pheophorbide a）进行实验，在光照下也能诱导细胞硬化，这直接将光致硬化与已知的ROS生成机制联系起来。

一个出乎意料的发现是，这种光致硬化效应并不依赖于细胞中通常负责维持细胞形状和硬度的“骨架”——肌动蛋白细胞骨架。即使使用细胞松弛素D（Cytochalasin D）和拉春库林A（Latrunculin A）等药物破坏肌动蛋白网络，光照引起的刚度增加依然发生，甚至相对增幅更大。这表明，光毒性导致的硬化可能源于更广泛的细胞内成分（如细胞质内的蛋白质）的ROS介导的交联，而非仅仅作用于细胞皮层。

从技术层面看，本研究主要依赖于轮廓微压痕技术进行单细胞力学表征，该技术通过测量细胞在已知力作用下的形变来计算其有效杨氏模量（刚度）。同时辅以原子力显微镜（AFM）对贴壁细胞进行纳米压痕测量以验证主要发现。细胞力学变化与ROS产生的相关性则通过双色荧光成像（如DCFH-DA与CellTracker Red共用）进行同步监测。研究中使用了多种细胞模型，包括原代CD4⁺T细胞（来源于健康供体）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）细胞系、人早幼粒白血病PLB-985细胞系（分化為中性粒细胞样）以及RAW 264.7巨噬细胞细胞系。

微压痕技术实现细胞力学变化的量化

研究人员利用轮廓微压痕技术，在精确控制的光照条件下对细胞进行力学测试。通过“前后对照”实验方案（先两次压痕测基础刚度，接着10秒光照，再两次压痕测光照后刚度），发现负载DCFH-DA的T细胞在蓝光照射后刚度增加了约10倍，负载Hoechst的T细胞在紫外线照射后刚度增加了约4倍，而负载Fl_uo-4的T细胞在蓝光照射后刚度增加了约2.6倍。这种光致硬化现象在不同细胞类型（如PLB细胞和BAECs）中也得到证实。

光致硬化影响T细胞活化过程中的主动变形

在T细胞活化模型中，负载Fl_uo-4的T细胞在接触抗体包被的微珠后通常会伸出大型伪足。然而，研究显示，在伪足生长过程中开启蓝光照射，伪足的延伸会在1-5秒内突然停止，且停止所需的时间与光照强度成反比（100%功率约1.6秒，10%功率约4.7秒）。这表明光致硬化迅速抑制了细胞依赖细胞骨架重组进行的主动形态变化。

剂量累积与ROS产生正相关

通过多周期实验方案（连续进行12次压痕，其中后10次每次压痕后伴随4秒光照），研究人员观察到细胞刚度随光照剂量累积而逐渐增加。降低光照功率会减缓硬化速率，但效应在较高功率下出现饱和。利用双色荧光技术同步监测刚度与DCFH-DA荧光强度（指示ROS水平），发现二者在光照初期同步上升，证实了刚度增加与细胞内ROS积累的直接关联。

光致硬化机制的深入验证

为确认ROS的核心作用，研究发现外源性添加H₂O₂可模拟光照效应，引起T细胞和BAECs的硬化。使用光敏剂脱镁叶绿酸a并照射紫外线，同样诱导了BAECs的硬化，且将其封装于胶束中增强其细胞摄取和ROS产生能力后，硬化效应更为显著。值得注意的是，破坏肌动蛋白细胞骨架并未消除光致硬化，反而使相对刚度增加更明显，表明硬化主要作用于细胞内部而非仅依赖于皮层肌动蛋白。

原子力显微镜对贴壁细胞光致硬化的验证

使用原子力显微镜对贴壁的RAW 264.7巨噬细胞进行纳米压痕实验，在较低的照射强度下，负载DCFH-DA的细胞在蓝光照射后仍能检测到显著的刚度增加（37%），而负载Fl_uo-4的细胞效应较弱，这与微压痕实验中观察到的染料和剂量依赖性效应一致，支持了主结论的普适性。

本研究系统性地揭示并定量表征了一种此前被忽视的快速光毒性效应——光致细胞硬化。研究证实，荧光显微镜常用的激发光能在数秒内通过诱导荧光探针产生ROS，引起多种细胞发生显著的、剂量依赖性的、且持久的刚度增加。这一效应足以瞬间抑制像T细胞活化这样的动态细胞过程，并且不依赖于肌动蛋白细胞骨架的完整性，提示其可能源于ROS介导的细胞内蛋白质等大分子的广泛交联。

该研究的重大意义在于，它将细胞力学性质的变化确立为一种定量、敏感且快速的光毒性评估指标。相较于传统方法，测量刚度变化能够实时反映光照的即时影响，为优化活细胞成像参数（如光照强度、时间、探针选择）提供了直观的判据。此外，该发现对光动力疗法（PDT）等领域也具有启示意义，细胞硬化的程度或许可作为评估PDT疗效的新型生物物理标志物。更重要的是，这项研究提醒所有使用荧光显微镜的研究者，必须高度重视并有效控制光毒性问题，在进行图像采集时，需要在图像质量与细胞活性之间寻求最佳平衡，以免对观测结果产生误导。最后，一个有趣的开放性问题是，在生理条件下，细胞是否会利用ROS作为一种调节自身力学性质的信号分子，这为未来的研究指明了新的方向。