α-突触核蛋白在宽泛条件下与脂质膜协同结合的稳健性研究

《Cell Reports Physical Science》：α-Synuclein cooperative binding to lipid membranes is a robust property over a wide range of conditions

本研究针对α-突触核蛋白（αSyn）与带负电荷脂质膜相互作用的协同性机制展开系统研究。通过调控pH值（5.5-7.5）和离子强度（1-23 mM），结合H50Q突变体分析，发现αSyn在不同条件下均呈现正协同结合特性。研究证实膜介导效应而非直接蛋白相互作用是驱动协同性的主要因素，为理解αSyn在帕金森病中的作用机制提供了新视角。相关成果发表于《Cell Reports Physical Science》。

　　

在神经科学领域，α-突触核蛋白（αSyn）一直扮演着谜一般的角色。这种富含于神经元突触的蛋白质，浓度高达50μM，既参与正常的生理功能如囊泡运输和膜重塑，又与帕金森病（PD）的发病机制密切相关。当αSyn发生错误折叠和聚集，会形成路易体和路易神经突，这些异常包涵体成为帕金森病的典型病理特征。然而，科学家们至今未能完全阐明αSyn从生理功能转向病理毒性的关键转折点。

特别令人困惑的是，αSyn作为一种天然无序蛋白，在与带负电荷的脂质膜相互作用时，其N端区域会形成长达100个氨基酸的两亲性α螺旋，而C端则保持无序状态延伸在膜外。这种独特的结构转变如何调控？在不同细胞微环境条件下，αSyn与膜的相互作用又会发生怎样的变化？这些问题对于理解αSyn的生理功能和病理作用至关重要。

传统观点认为，蛋白质与膜的结合通常遵循独立结合模型，每个蛋白质分子独立地与膜结合。然而，近年来的研究发现αSyn与膜的结合表现出强烈的正协同性——蛋白质分子更倾向于聚集在已有蛋白质结合的膜区域，而非随机分布在整个膜表面。这种协同结合导致膜表面形成高密度蛋白质斑块，可能显著影响膜的性质和功能。考虑到αSyn在突触中参与神经递质释放、囊泡裂变和循环等与膜重塑密切相关的生理过程，理解其协同膜结合的分子机制变得尤为迫切。

为了揭示这一机制，由Noemi Ferrante Carrante领衔的研究团队开展了一项系统性的研究，旨在探索不同条件下αSyn与脂质膜协同结合的规律。研究人员通过精心设计的实验方案，分别调控溶液的pH值和离子强度，同时考察与早发性帕金森病相关的H50Q突变体的行为，以阐明静电相互作用在协同结合中的具体作用。

研究团队采用了多技术联用的策略，包括共聚焦显微镜、荧光相关光谱（FCS）、圆二色谱（CD）和微流控扩散尺寸分析（MDS），从不同角度全面表征αSyn与模型膜的相互作用。他们使用由DOPC（二油酰基磷脂酰胆碱）和DOPS（二油酰基磷脂酰丝氨酸）按7:3摩尔比组成的小单层囊泡（SUVs）和巨单层囊泡（GUVs）作为模型膜系统。

主要技术方法包括：通过共聚焦显微镜直接观察蛋白质在GUVs上的分布模式；利用FCS定量分析携带αSyn的囊泡比例；采用CD光谱监测蛋白质从无规卷曲到α螺旋的构象变化；运用MDS技术区分溶液中游离与膜结合的蛋白质。所有实验均在严格控制pH值和离子强度的缓冲体系中进行，确保结果的可靠性。

结合分布研究揭示协同性普遍存在

通过共聚焦显微镜观察，研究团队获得了直观的证据：在脂膜过量的条件下，αSyn仅与部分GUVs结合，而不是均匀分布在所有囊泡上。当蛋白质过量时，所有囊泡都能结合蛋白质。这种分离的结合模式在不同溶液条件下均被观察到，包括pH值从5.5到7.5，离子强度从1到23 mM的宽范围。

尤为重要的是，与早发性帕金森病相关的H50Q突变体在pH 5.5和离子强度1 mM条件下也表现出协同结合行为，表明这种协同性并不依赖于完整的蛋白质序列。

FCS定量分析进一步证实了这些观察结果。随着脂质与蛋白质比例（L/P）的增加，携带αSyn的囊泡数量达到平台期，而在更高的L/P比例下，这一数量保持稳定，表明只有一小部分囊泡含有αSyn。这一发现与GUVs观察结果高度一致，共同证明了αSyn协同结合的稳健性。

构象变化分析揭示膜上蛋白质密度受条件调控

CD光谱分析提供了关于αSyn在膜上密度的关键信息。随着L/P比例的增加，蛋白质的构象从无规卷曲逐渐转变为α螺旋，在222 nm处的平均残基椭圆度（MRE）信号增强并最终达到饱和。

研究发现，饱和点的位置强烈依赖于溶液条件。在固定离子强度（I=1 mM）下，随着pH值从5.5升高到7.5，饱和点对应的L/P比例从约160增加到400。类似地，在固定pH值下增加离子强度也会提高饱和点。例如，在pH 5.5时，将离子强度从1 mM增加到150 mM，饱和点至少提高了6倍。

MDS分析进一步揭示，在pH 7.5和I=1 mM条件下，即使在高L/P比例（900）下，溶液中仍存在游离蛋白质，而在pH 5.5和6.5的相同条件下，几乎所有蛋白质都与膜结合。这表明在高pH值下，αSyn在膜上的密度较低，是由于部分蛋白质未能与膜结合，而非每个结合蛋白质形成的α螺旋较短。

膜介导效应是协同性的主要驱动力

本研究最重要的发现之一是，αSyn与脂质膜的协同结合在各种条件下都保持稳健，表明这种特性是αSyn的内在属性，而非特定条件下的偶然现象。尽管静电相互作用在调节αSyn与膜的结合中起着核心作用，但它们并不是强协同性的分子起源。

研究人员估算，在低pH和低离子强度条件下，每个αSyn α螺旋可用的膜面积约为脂质头基面积的3倍，对应的约化密度ρ*接近刚性长棒各向同性向列相转变的理论阈值（4.71）。在这种密集堆积状态下，螺旋在膜上有序排列，旋转自由度降低。而在高离子强度（I=150 mM）或高pH值条件下，可用膜面积增加3-5倍，意味着蛋白质层更加松散。

特别值得注意的是，协同结合甚至可以在膜上蛋白质密度较低的情况下发生，表明密集堆积并非正协同性的先决条件。这一发现排除了直接蛋白质-蛋白质相互作用作为协同性主要驱动力的可能性，将焦点转向了膜介导的机制。

可能的膜介导机制包括毛细管效应、移动脂质在刚性蛋白质附近的耗竭、膜弯曲或卡西米尔类效应。考虑到一个100个氨基酸长的αSyn α螺旋在膜上占据约18 nm2的面积，而每个脂质头基面积约为0.65 nm2，一个αSyn的结合会扰动至少30个脂质分子，因此脂质耗竭可能是驱动蛋白质在膜上聚集的重要因素。

此外，蛋白质结合可能诱导局部膜曲率，而蛋白质聚集可能降低总的弯曲自由能。αSyn带正电的细长形状平行于膜界面取向，即使在低浓度下也可能通过膜介导相互作用自发聚集。热卡西米尔类波动通过最大化膜波动熵也可能促进蛋白质聚集，尽管这一机制主要适用于刚性且紧密膜结合的蛋白质。

生理和病理意义

本研究的结果对理解αSyn的生理功能和病理作用具有重要意义。细胞内不同区室的pH值存在显著差异，从溶酶体的酸性环境（pH≈5.5）到早期内吞体（pH≈6.5）和接近中性的细胞质（pH≈7.5）。同时，离子浓度和组成也各不相同。这些因素可以调节αSyn在膜上的密度，进而影响膜变形过程。

更密集的蛋白质层预计会诱导更大的曲率，这与αSyn在囊泡运输和膜重塑中的 proposed 生理功能相一致。考虑到突触处神经递质释放、囊泡裂变和循环都涉及膜形状的重大变化，αSyn通过协同结合形成高密度斑块可能为这些过程提供必要的机械力。

对于H50Q突变体，研究发现其保留协同膜结合能力，但膜上堆积密度显著降低，约为野生型的三分之一。这种差异可归因于组氨酸被谷氨酰胺取代后，N端膜结合区域吸引相互作用的减弱。这表明H50Q携带者的早发性帕金森病很可能不是由于协同膜结合的丧失，而是由于膜上蛋白质密度的改变影响了其生理功能。

综上所述，本研究系统阐明了αSyn与脂质膜协同结合的稳健特性，揭示了膜介导效应而非直接蛋白质相互作用或静电效应是协同性的主要驱动力。这些发现不仅深化了对αSyn-膜相互作用物理基础的理解，也为探索αSyn生理功能和病理机制提供了新的视角。该研究强调的膜介导协同机制可能适用于其他膜结合蛋白，为理解蛋白质-膜相互作用的一般原理提供了重要参考。