乳腺癌来源的外泌体miR-92a-3p通过促进TLR4/NF-κB介导的巨噬细胞M2极化来加速恶性进展

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Breast cancer-derived exosomal miR-92a-3p stimulates malignant progression by driving TLR4/NF-κB-mediated macrophage M2 polarization

乳腺癌外泌体中miR-92a-3p通过激活TLR4/NF-κB通路促进M2巨噬细胞极化，加速肿瘤进展，该分子是乳腺癌治疗的重要靶点。

　　

丁胜|王健|裴静

安徽省马鞍山市马鞍山市人民医院甲状腺与乳腺外科，243000，中国

摘要

乳腺癌（BC）细胞衍生的外泌体显著重塑了肿瘤微环境；然而，驱动肿瘤进展的关键机制仍不清楚。本研究使用透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子追踪分析（NTA）和Western blotting技术分析了来自MCF-10A正常乳腺上皮细胞和MDA-MB-231/MCF-7乳腺癌细胞的外泌体。用肿瘤来源的外泌体处理亲本BC细胞显著增强了其恶性特征，而来自miR-92a-3p敲低细胞的外泌体则逆转了这些恶性表型。通过对EVMiRNA数据库的生物信息学分析，最初确定miR-92a-3p是BC患者血液中外泌体中上调最显著的miRNA。这一发现通过qRT-PCR得到了验证，结果显示肿瘤来源的外泌体中miR-92a-3p的表达显著升高。外泌体中的miR-92a-3p诱导THP-1来源的巨噬细胞向M2极化，表现为Arg-1、Ym1和IL-10的mRNA水平升高，CD206⁺细胞比例增加；同时IL-10分泌增加而TNF-α分泌减少。从机制上看，亲本外泌体激活了巨噬细胞中的TLR4/NF-κB通路，导致TLR4和磷酸化p65的表达增加，而miR-92a-3p敲低的外泌体则抑制了这一通路的激活。重要的是，我们通过荧光素酶报告基因实验确认miR-92a-3p直接靶向TLR4的3’非翻译区（3’UTR）。总之，肿瘤来源的外泌体miR-92a-3p具有双重作用：它直接增强BC细胞的侵袭性，并通过激活巨噬细胞中的TLR4/NF-κB轴促进M2极化，从而加速肿瘤进展。这些发现突显了miR-92a-3p在肿瘤-外泌体相互作用中的关键作用，并将其确定为BC治疗的一个有前景的目标。

引言

根据GLOBOCAN 2022年的统计数据，乳腺癌已成为全球女性中最常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因[1]。2022年，全球乳腺癌发病率约为230万例，占所有新诊断癌症的11.7%，死亡率占癌症总死亡数的6.9%[2]。值得注意的是，在埃塞俄比亚等低收入国家，乳腺癌占女性癌症的29.3%-37%，约80%的患者在晚期（III/IV期）被诊断出来——这一比例远高于高收入国家的15%[3]。目前乳腺癌的主要治疗方法包括手术、放疗、化疗和其他手段[4]。手术旨在切除肿瘤组织，但对于晚期或转移性患者往往无效[5]，[6]。化疗可以靶向并杀死癌细胞，但缺乏特异性，常导致严重的副作用，如骨髓抑制、恶心、呕吐和脱发，这些副作用严重影响了患者的生活质量[5]，[6]。放疗使用局部高能辐射来攻击肿瘤，但也可能损伤周围的健康组织[5]，[6]。内分泌疗法是治疗激素受体阳性乳腺癌的核心方法；然而，长期使用后常常会出现药物耐药性[7]。靶向治疗能够精确作用于特定的分子靶点，但其适用范围有限，且治疗成本较高[8]。尽管采取了这些方法，复发和转移仍然是严重影响患者预后的重大挑战。因此，迫切需要阐明乳腺癌发病机制和转移的分子基础，以及寻找更有效和更安全的治疗靶点和策略来克服耐药性。

外泌体是由各种细胞（包括癌细胞）分泌的细胞外囊泡（30-100纳米），被脂质双层膜包裹[9]。它们可以转移到微环境中的目标细胞，改变其表型并促进肿瘤生长和转移[10]，[11]。外泌体携带的物质包括蛋白质、脂质、DNA、mRNA和microRNAs（miRNAs）[12]。其中miRNAs特别值得关注，因为它们可以在转录后水平调节目标基因的表达[13]。研究表明，来自膀胱癌细胞的外泌体通过miR-1247-3p加速血管生成[14]。miR-934的细胞外分泌促进了结直肠癌的恶性进展[15]。肿瘤来源外泌体中miR-92a-3p的失调促进了多种类型癌症的起始和进展，包括胃癌、结直肠癌和肝细胞癌[16]，[17]，[18]。然而，miR-92a-3p在乳腺癌中的作用仍不明确。

肿瘤微环境（TME）在肿瘤起始、转移和治疗抵抗中起着关键作用[19]。作为肿瘤基质中最丰富的免疫成分，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）会根据微环境刺激在M1（经典激活）和M2（替代激活）功能状态之间动态转换[20]，[21]。M2巨噬细胞通过分泌抗炎因子和各种生长因子（如表皮生长因子EGF）显著促进组织修复和肿瘤进展[22]。研究表明，肿瘤细胞可以通过复杂的信号通路招募和激活M2巨噬细胞，从而促进癌症转移和耐药性[23]，[24]。例如，在口腔鳞状细胞癌中，M2巨噬细胞分泌的RACK1蛋白促进了癌症转移[25]。此外，miR-934诱导的M2/M1巨噬细胞比例增加促进了结直肠癌的发展[26]。然而，在某些特定类型的癌症中，其分子机制尚未完全明了，特别是在乳腺癌中的作用仍需进一步研究。

研究发现，miR-92a-3p在乳腺癌来源的外泌体中显著上调，并在促进乳腺癌恶性发展和调节TME方面发挥双重作用。具体来说，我们证明miR-92a-3p通过两种方式发挥作用：首先，它通过增强癌细胞的增殖、迁移和侵袭来加速肿瘤进展；其次，它通过TLR4-NF-κB信号通路诱导M2巨噬细胞极化。

实验部分

细胞

MDA-MB-231（CL-0150）、MCF-10A（CL-0525）、MCF-7（CL-0149）和人单核细胞THP-1（CL-0233）细胞系均来自Procell（武汉，中国）。使用MEM培养基（用于MCF-7细胞，Gibco）、高葡萄糖DMEM培养基（用于MCF-10A和MDA-MB-231细胞，Procell）和RPMI-1640培养基（用于THP-1细胞，Procell）进行细胞培养。所有细胞在含有FBS（10%，Gibco）和P/S（1%，Gibco）的相应培养液中培养。这些细胞在恒定温度下培养

外泌体的制备

在本实验中，成功从MCF-10A细胞（人正常乳腺上皮细胞）和BC细胞（MCF-7、MD-MB-231）的上清液中分离出了外泌体。TEM清晰地显示了外泌体的特征性双层膜结构和圆形囊泡形态，直径范围为30至150纳米（图1A-C）。此外，NTA表明外泌体的大小分布均匀，平均粒径分别为110.0纳米、110.7纳米和109.2纳米。

讨论

乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因[29]。即使肿瘤被完全切除，仍有三分之一的患者会出现肿瘤复发[30]。本研究表明，TLR4-NF-κB通路是外泌体miR-92a-3p驱动的M2巨噬细胞极化和肿瘤进展的关键中介，为乳腺癌的发病机制和免疫逃逸提供了新的见解。

肿瘤来源的外泌体在

CRediT作者贡献声明

裴静：写作——审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。王健：可视化、验证、软件使用、资源提供、方法论。丁胜：原始稿撰写、可视化、验证、软件使用、资源提供、方法论、实验设计、数据分析、数据管理

数据可用性声明

数据和材料可应合理要求提供。

资助

本研究得到了2023年安徽省健康科学研究项目（项目编号AHWJ2023A20096）和安徽医科大学第一附属医院临床研究启动计划项目（项目编号LCYJ2021YB008）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

不适用。