Celastrol与MEK1抑制剂nedometinib协同作用，通过双重抑制CDK1/CDC5L以及由反馈机制激活的Akt/STAT3信号通路，克服膀胱癌的耐药性

《Biochemical Pharmacology》：Celastrol synergizes with MEK1 inhibitor nedometinib to overcome resistance in bladder cancer via dual suppression of CDK1/CDC5L and feedback-activated Akt/STAT3

联合抑制CDK1和CDC5L协同MEK1抑制剂显著抑制膀胱癌及直肠腺癌增殖并克服耐药机制，安全有效。

　　

吴双江|费雪玉|岳宣刘|余松宋|陈凯刘|珏刘|高刘|田瑞旭|俊桑

中国云南省昆明市昆明科技大学生命科学技术学院，邮编650500

摘要

膀胱癌，尤其是晚期和顺铂耐药的膀胱癌，由于治疗选择有限，构成了重大的临床挑战。在本研究中，我们证明了同时抑制周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）和类似细胞分裂周期5的蛋白（CDC5L）能够显著抑制膀胱癌细胞的生长。天然产物水飞蓟素（CST）以依赖活性氧的方式下调了顺铂耐药和PTEN突变膀胱癌细胞中的CDK1和CDC5L表达。将CST与特定的MEK1抑制剂nedometinib（NB）联合使用，能够协同增强CDK1和CDC5L的下调，促进细胞凋亡和活性氧的积累，并显著抑制体内异种移植肿瘤的生长。机制上，NB单药治疗会触发促生存的Akt和STAT3通路的补偿性激活，而添加CST可以有效对抗这种耐药机制。此外，CST?+?NB组合在CDK1、CDC5L和MEK1共表达的直肠腺癌中也显示出疗效。该组合方案具有良好的安全性，未观察到系统性的或神经行为毒性。我们的结果表明，CST通过双重抑制CDK1和CDC5L，并通过与MEK1抑制剂的协同作用来抑制反馈驱动的耐药通路，从而显示出强大的抗膀胱癌活性。

引言

膀胱癌，尤其是晚期和顺铂耐药的膀胱癌，由于治疗选择有限和患者生存率低，构成了重大的治疗挑战[1,2]。这凸显了迫切需要新的、有效的治疗策略。现代肿瘤学研究不断发现癌细胞中的关键脆弱性。周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）在膀胱癌中过度表达，并与肿瘤进展相关，其抑制已被证明可以抑制癌细胞增殖[3]。同样，对细胞分裂周期5相关蛋白（CDC5L）的功能性抑制也能阻碍膀胱癌细胞的生长[4]。值得注意的是，我们的初步生物信息学分析显示CDK1和CDC5L表达之间存在强烈的正相关，这使我们推测同时抑制这两个靶点可能是一种新的、有效的膀胱癌治疗策略。

丝裂原活化蛋白激酶1/2（MEK）1/2是MEK/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路中的关键激酶，已成为经过验证的抗癌靶点，针对这些激酶的抑制剂已被开发为抗肿瘤药物[5]。Trametinib（TB）和cobimetinib（CB）已被欧洲药品管理局和美国食品药品监督管理局批准用于治疗恶性黑色素瘤[5]。NB（NFX-179）是一种特定的MEK1抑制剂，可以抑制皮肤鳞状细胞癌的增殖[6]。二期临床试验显示其在治疗神经纤维瘤病1型（NCT05005845）中具有良好的安全性和潜在的治疗效果[7]。MEK1/2信号通路与膀胱癌进展密切相关，其抑制已被证明是一种有效的治疗策略，例如trametinib（TB）通过诱导细胞周期停滞来抑制肿瘤生长[8]。然而，MEK1/2抑制剂的疗效常常受到获得性耐药性的限制，这种耐药性通常是通过激活促生存通路（如磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Akt）和Janus激酶/信号转导子和转录激活因子3（STAT3）来介导的[9]。因此，需要创新策略来克服这些耐药机制。

最近的研究表明，同时靶向CDK1和MEK/ERK通路是治疗结直肠癌的有希望的策略[10]。我们的生物信息学分析显示，MEK1表达在膀胱癌中与CDK1和CDC5L有显著相关性，而MEK2表达则没有显著关联。这种MEK1特异性的相互作用表明，选择性抑制MEK1可能与同时靶向CDK1和CDC5L的策略具有协同作用。因此，开发能够同时抑制CDK1、CDC5L和MEK1，并有效对抗补偿性耐药通路的治疗药物或策略，是一个重要的未满足的医疗需求。

来自传统药用植物的天然产物因其多靶点作用机制而成为抗癌药物发现的宝贵资源[11]。雷公藤（Tripterygium wilfordii） Hook. f.（在中医中称为雷公藤）长期以来被用于治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病以及恶性肿瘤[12]。其活性成分水飞蓟素（CST）在多种癌症中表现出抗增殖作用[13]。在本研究中，我们发现CST能够有效抑制顺铂耐药和磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）突变膀胱癌细胞的增殖。同时敲低CDK1和CDC5L可产生强烈的抗增殖效应，且CST以依赖活性氧的方式下调了CDK1和CDC5L的表达。此外，NB增强了CST诱导的CDK1和CDC5L下调作用，并增强了其促凋亡活性。重要的是，CST抑制了NB诱导的Akt和STAT3通路的反馈激活。CST和NB的组合在体外和体内均表现出协同的抗膀胱癌效果，且无明显的毒性。此外，CST?+?NB组合在CDK1、CDC5L和MEK1共表达的直肠腺癌中也显示出强大的抗增殖活性。总体而言，这些结果表明CST?+?NB组合是一种有前景的多靶点治疗策略，具有良好的安全性。

化学物质和抗体

水飞蓟素（CST，纯度≥98%）购自成都DESITE生物技术有限公司（中国成都）。MK2206、Stattic、NB、CB和TB购自MedChemExpress（美国蒙茅斯 junction）。谷胱甘肽（GSH）和N-乙酰半胱氨酸（NAC）购自Solarbio（中国北京）。抗p-ERK（#4695S）、p-Akt（#4046S）、p-p53（#9284T）、切割型caspase-7（c-cas-7，#9491）和p-STAT3（#9145S）抗体购自Cell Signaling Technology（美国波士顿）；CDK1抗体

CDK1和CDC5L的共抑制可抑制膀胱癌细胞生长

UALCAN数据库的分析显示，膀胱癌组织中的CDK1表达显著高于正常组织，且表达水平与肿瘤分期密切相关（图1A）。GEPIA数据库的分析也证实了这一现象（图1B）。此外，人类蛋白质图谱数据库的数据表明高CDK1表达与患者生存率降低之间存在显著相关性（p<0.05）（图1C）。在顺铂耐药的膀胱癌细胞中敲低CDK1

讨论

具有多样结构和强大生物活性的天然产物为抗肿瘤药物发现提供了宝贵的资源[11,18,19]。在本研究中，我们通过结合天然化合物CST和选择性MEK1抑制剂NB，提出了一种新的、高度协同的抗膀胱癌治疗策略，该策略也可能适用于其他实体瘤。我们的结果揭示了这种协同作用的多层机制基础：

CRediT作者贡献声明

吴双江：验证、资源、实验设计。费雪玉：实验研究。岳宣刘：数据可视化。余松宋：软件操作、资源管理。陈凯刘：软件编程。珏刘：数据分析。高刘：撰写、审稿与编辑、方法学设计。田瑞旭：项目监督、资金获取。俊桑：初稿撰写、方法学设计、资金获取、数据管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本研究得到了云南省自然科学基金（编号202401CF070152）、中国自然科学基金（编号32160157）以及云南省重大科技项目-昆明科技大学双一流专项（编号202202AG050008）的财政支持。我们还要感谢Xu实验室的成员在技术上的协助和讨论。同时，我们也感谢Da-Li Sang和Er-Hua Liu的鼓励和支持。