计算机智能定制的CHA-氧化石墨烯-DNA电路，用于多重miRNA检测和精确的癌细胞识别

《Biosensors and Bioelectronics》：Computer-intelligent customized CHA-graphene oxide-DNA circuit for multiplex miRNA detection and accurate cancer cell identification

提出了一种结合计算机智能定制技术与石墨烯氧化物的荧光生物传感器，实现溶液和细胞中miRNA-21与miRNA-30a的超高灵敏度、多联同步检测，为早期癌症诊断和亚型鉴别提供理论和技术支持。

　　

刘美音|宋宇辰|刘梅如|娄子轩|邓冬梅|游宇|严晓霞|罗利强

上海大学理学院，中国上海200444

摘要：

在癌症分子亚型的分析中，miRNA是重要的肿瘤标志物。尽管人工设计的DNA电路已被广泛使用，并在miRNA检测中表现出高灵敏度，但其低效率和缺乏高通量限制了它们的实际应用。本文提出了一种基于荧光生物传感器的方案，该传感器结合了计算机智能定制技术，能够实现对溶液中及细胞内miRNA-21和miRNA-30a的超灵敏、多重同时检测。计算机智能定制技术用于精确输出DNA电路元件，而氧化石墨烯则用于淬灭荧光并作为将DNA电路导入细胞的载体。当目标miRNA存在时，会触发催化发夹组装反应，从而产生荧光信号放大。在最佳条件下，miRNA-21和miRNA-30a的检测限分别为12.46 aM和10.64 aM，可在30分钟内被检测到（浓度范围为20 aM–200 nM）。这项工作为早期癌症诊断、治疗和亚型鉴定提供了重要的理论指导与实际价值。

引言

恶性肿瘤由于其高度异质性和复杂的分子机制，对人类健康构成了严重威胁（Dunn等人，2004年；Jiang等人，2021年；Crosby等人，2022年）。随着精准医学的不断发展，癌症分子亚型的分析已成为优化治疗方案的关键环节。在各种相关分子标志物中（Martin等人，2024年），microRNA（miRNA）表达谱的异常不仅与癌症的发生密切相关，还为亚型区分提供了重要依据（Agbu和Carthew，2021年；Chen和Wang，2020年）；因此，准确检测miRNA已成为癌症分类研究中不可或缺的核心技术要求（Acunzo等人，2015年）。

在分析领域，定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）被认为是该领域的“金标准”（Yang等人，2021年；Lan等人，2020年）。然而，研究人员发现等温核酸扩增技术不需要qRT-PCR所需的专用温度控制设备（Luo等人，2022年；Hsiao等人，2021年；Wang等人，2024年；Zhang等人，2020年），并且能够在保持良好灵敏度和特异性的同时有效提高检测效率（Bhatt等人，2022年；Waller等人，2022年；Zhang和Tanner，2022年；Oliveira等人，2021年）。其中，催化发夹组装（CHA）作为一种典型的等温核酸扩增技术，因其无需酶而受到广泛关注（Liu等人，2019年；Song等人，2024年）。进一步的研究发现，动态DNA电路可以与CHA实现精确高效的协同作用。通过DNA杂交和链位移等动态过程（Lv等人，2023年；Okamoto等人，2004年；Wang等人，2022年），这些DNA电路不仅能够准确传递目标信息并输出信号，还能优化CHA的扩增效率（Zhao等人，2023年；Liu等人，2024年），从而提升检测性能。

在早期研究中，研究人员通过手动设计核酸序列等策略来检测低丰度miRNA（Fabrice等人，2024年；Mao等人，2024年）。然而，随着临床对miRNA检测需求的增长，DNA电路设计已从手动模式转向计算机辅助模式，这种模式以算法和软件驱动的自动化核酸序列设计为特征，显著提高了设计效率和准确性。如今，计算机能够处理人类难以完成的复杂任务（Vetturini等人，2025年；Liu等人，2022年），为突破miRNA检测的技术瓶颈奠定了基础。尽管当前的miRNA检测技术具有高灵敏度和特异性，但它们仍难以实现进一步的多重分析，这一难题已成为限制其大规模临床应用的关键瓶颈。

为了解决上述瓶颈，本研究将DNA电路与CHA反应结合，在氧化石墨烯（GO）上构建了一种新型催化DNA电路，并引入了计算机智能定制（CIC）技术来精确设计DNA电路元件。GO被用作载体，使DNA电路能够导入细胞（Javed等人，2022年；Singh等人，2020年；Zhang等人，2021年），其荧光淬灭特性可以减少背景信号（Mukherjee等人，2020年；Zhang等人，2021年；Amiryaghoubi等人，2020年；Xie等人，2020年）。电路内的多级链位移反应可以防止信号泄漏，确保高特异性。此外，通过CIC技术设计元件序列可以显著降低与序列设计相关的劳动成本和错误率，同时避免不同miRNA检测系统之间的序列干扰。由此产生的CHA、GO和DNA电路的集成系统（命名为CGC）能够实现miRNA-21和miRNA-30a的同时荧光检测，检测限分别低至12.46 aM和10.64 aM。这项工作实现了癌细胞的识别，并为后续的癌症及其亚型鉴定研究提供了理论视角和技术保障。

材料与试剂

HPLC纯化的寡核苷酸（表S1）和10 bp DNA标记物购自Sangon Biotech有限公司（中国上海）。GO来自Sigma-Aldrich（美国）。云峰有限公司（中国）提供了云母片。Generay Biotech有限公司（中国上海）提供了5×加载缓冲液。磷酸盐缓冲盐水（PBS）、miRNA第一链cDNA合成试剂盒（bystem-loop）和miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix由Vazyme Biotech有限公司（中国南京）提供。

结果与讨论

在本研究中，基于CIC技术开发了一个辅助的核酸序列设计程序。如图1所示，依次输入多组目标miRNA（Target），CIC程序输出六个电路元件：Guard、Reporter、Hairpin、Track1、F-DNA和Track2。当Target与单链DNA（ssDNA）的发夹结构（Hairpin）结合时，发夹结构打开，暴露其结合位点。随后Hairpin与Track1完全结合形成稳定的双链DNA。

结论

总之，通过利用CIC技术，我们开发了一种新型催化DNA电路，将CHA扩增与GO结合，实现了对溶液中及活细胞内miRNA-21和miRNA-30a的高灵敏度双重检测。该系统能够在短时间内精确识别癌细胞，并为后续的癌症及其亚型鉴定研究提供了理论见解和技术支持。

CRediT作者贡献声明

罗利强：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。娄子轩：实验研究。邓冬梅：撰写 – 审稿与编辑，概念构思。游宇：监督，概念构思。严晓霞：实验研究。刘美音：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，可视化，监督，方法学，实验研究。宋宇辰：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，监督，方法学，实验研究。刘梅如：方法学，概念构思

未引用参考文献

Kang等人，2022年；Zhang等人，2021年。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号61971274、62171268和62571308）的资助。