肝素三糖合成的探索：供体评估以及一种意外的葡糖醛酸受体（吡喃糖）参与呋喃糖环缩合的过程

《Carbon Capture Science & Technology》：Exploration of a heparosan trisaccharide synthesis: donor evaluation and characterisation of an unexpected glucuronic acid acceptor pyranose to furanose ring contraction

heparan sulfate与heparosan的结构差异及化学合成策略研究，重点优化[2+1]糖苷化策略中anomeric deacetylation条件，发现dibutyl phosphate donor可提升合成效率，并首次鉴定酸诱导的furanose环收缩副产物12b，通过NMR和质谱解析其形成机制，最终获得目标trisaccharide 1，为糖胺聚糖模拟物研究提供新平台。

　　
heparan sulfate（肝素硫酸）是一种在动物细胞表面和细胞外基质中广泛存在的线性多糖，其硫酸化基团赋予其强负电荷特性，这对调控细胞增殖、分化和血管生成等关键生理过程至关重要。近年来，heparan sulfate的结构与功能研究揭示了其在癌症、阿尔茨海默病和病毒感染等疾病中的潜在作用，促使科学家尝试通过化学合成手段获取其结构类似物heparosan（肝素）。heparosan作为细菌 capsular多糖（如大肠杆菌K5、巴氏杆菌等），其分子骨架由β-D-葡萄糖醛酸（D-GlcA）和α-D-葡萄糖胺（D-GlcN）交替组成的重复二糖单元构成，但关键区别在于heparosan完全脱硫，而heparan sulfate含有大量硫酸化基团。

该研究团队旨在通过化学合成获得heparosan的模拟物——三糖片段1，并探索合成过程中可能产生的意外副产物及其形成机制。研究采用[2+1]糖基化策略，即通过两次糖苷键连接形成三糖链。首先合成关键中间体二糖供体5a-d，其核心策略是通过铜催化开环反应将1,6-内酯环转化为具有还原端特征的二糖，并优化脱乙酰基反应条件以获得高纯度产物。在合成过程中发现，传统Fmoc（甲氧羰基）脱保护条件会导致副反应，改用氢氧化肼-醋酸体系在混合溶剂中（CH2Cl2/甲醇）可显著提升产率至77%，同时避免Fmoc基团被意外水解。

接下来，研究团队开发了新型糖苷供体体系。通过将二糖供体与D-GlcA单糖接受体进行糖基化反应，形成三糖中间体12a。值得注意的是，在磷酸供体5c的活化过程中，使用了过量三氟甲磺酸钛（TMSOTf）引发磷酸酯化反应，但此方法导致副产物12b的生成。NMR分析显示，12b的D-GlcA残基呈现呋喃环特征（化学位移106.5 ppm，耦合常数175 Hz），这与文献中酸性条件下糖苷键环化形成呋喃环的机制一致。研究进一步指出，这种环化副反应可通过控制反应pH值、使用酸性条件下的螯合剂（如TfOH）或调整糖苷化顺序来抑制。

在最终产物的纯化阶段，研究团队创新性地采用两步脱保护策略：首先将三糖中间体的硝基末端转化为乙酰基（68%产率），随后通过酸性水解去除乙酰基保护，获得游离三糖1。这一过程中发现，Fmoc基团的存在会显著影响后续反应的活性，因此优先脱Fmoc基团可获得更高的乙酰化效率（89% vs 68%）。

该研究不仅为heparosan的化学合成提供了高效路线（总产率40%-75%），更重要的是揭示了糖苷化反应中难以预测的酸性副反应机制。特别是发现TMSOTf活化磷酸供体时释放的微量TfOH可能诱导糖环的酸催化环化，这一发现对糖基化反应的条件控制具有重要指导意义。此外，研究团队通过对比不同供体（咪唑盐、磷酸酯、亚磷酸酯）的适用性，证实二糖供体5c（二丁基磷酸酯）在产率和反应选择性方面表现最优，最终生成的三糖1纯度达到92%以上，为后续的生物学功能验证奠定了基础。

在应用前景方面，heparosan三糖1的还原端带有可修饰的磷酸基团，其3'羟基和末端的游离氨基为功能化提供了多个反应位点。研究特别提到，通过将三糖1与聚合物或蛋白质结合，可构建具有特定生物活性的材料，例如模拟肝素硫酸与生长因子受体结合的功能。此外，副产物12b的发现为开发新型呋喃糖苷类抗生素提供了潜在方向，因为这类结构在细菌细胞壁合成中具有特殊作用。

研究团队还通过系统筛选（共测试5种脱乙酰基条件），优化了二糖供体3的合成步骤，将总产率从文献报道的60%提升至87%（两步法）。在糖苷化阶段，采用预活化的供体与受体的顺序，使三糖1的产率稳定在40%以上。这些技术突破为复杂糖类化合物的规模化生产提供了可行方案。

特别值得关注的是，该研究首次系统报道了糖苷化过程中酸性条件诱导的糖环环化现象。通过比较不同供体体系的副产物生成模式，发现磷酸酯供体在活化时释放的酸性物质更容易触发这种副反应，而咪唑盐供体由于自身弱酸性环境，则能较好地抑制呋喃环的形成。这一发现不仅完善了糖化学合成的基础理论，更为工艺优化指明了方向——在需要强酸性活化条件时，应同步添加碱性螯合剂以中和产生的微量酸。

在实验设计上，研究团队采用了"预防-监测-利用"的三阶段策略。首先通过预实验确定各中间体的合成路径，其次在关键步骤（如糖苷化）中设置多组对照实验，最后对意外生成的副产物12b进行结构解析和功能评估。这种严谨的科研方法论为后续类似糖类合成研究提供了范式参考。

当前，heparosan的合成主要依赖生物酶法，存在成本高、产率低和难以精确控制手性中心的缺陷。本研究通过化学全合成路线，成功在实验室环境下制备出具有生物活性的heparosan三糖1，其关键创新点在于开发新型二糖供体体系（如5a-d）和优化糖苷化反应条件。特别地，通过引入C2位酯基保护策略，实现了β-糖苷键的高选择性形成（α:β=14:86），这一选择性较传统方法提升了一个数量级。

在产业化前景方面，该研究提出的[2+1]糖基化策略可扩展至更长寡糖的合成。例如，通过模块化设计将不同二糖供体与单糖受体组合，可快速构建具有特定构效关系的多糖链。此外，研究发现的副产物12b的呋喃环结构可能具有独特的生物活性，未来可深入探索其应用价值。

综上所述，该研究在糖化学合成领域取得多项突破：首次实现heparosan三糖的化学全合成；揭示酸性条件下的糖环环化副反应机制；开发新型二糖供体体系（5a-d）和优化糖苷化反应条件；发现具有潜在应用价值的副产物结构。这些成果不仅为糖类药物研发提供了新工具，更为复杂多糖的合成生物学提供了重要参考，对揭示糖类在生命过程中的分子机制具有重要科学价值。