一种在益生菌平台中合成的含有整合素结合基序的羟基化类胶原蛋白结构：合成、结构稳定性及体外生物活性

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：A Hydroxylated Collagen-like Construct with an Integrin-Binding Motif Produced in a Probiotic Chassis: Synthesis, Structural Stability, and in-vitro Bioactivity

重组人III型胶原蛋白样蛋白R8在大肠杆菌Nissle 1917中高效表达并修饰，实现60%羟脯氨酸转化率及内毒素污染减少，其结构稳定性和生物相容性显著优于传统系统。

　　

郑正|张静|郑丽辉|赵文静|刘唐琳|吴佳静|苏伟|黄宇辰|罗世静|王聪|金明飞|黄静

华东师范大学生命科学学院，上海，200241，中国

摘要

在大肠杆菌中重组生产胶原蛋白对于推动生物医学应用至关重要，但这一过程经常受到一些关键挑战的阻碍，尤其是内毒素污染和脯氨酸羟基化不足的问题。为了解决这些限制，我们改造了益生菌大肠杆菌 Nissle 1917 (EcN)，使其成为生产一种名为R8的羟基化人类III型胶原蛋白的载体。通过将R8与炭疽杆菌的脯氨酸4-羟化酶（BaP4H）在EcN中共表达，我们获得了0.26 mg/mL的羟基化胶原蛋白产量。羟基化率达到60%，LC–MS/MS分析证实65个脯氨酸残基中有33个发生了修饰。羟基化R8具有更好的热稳定性，能够保持其三螺旋结构并形成多孔纤维网络。重要的是，在巨噬细胞活化实验中，EcN产生的R8显示出较低的免疫原性，这与传统的大肠杆菌 BL21(DE3)产生的材料形成鲜明对比。此外，羟基化R8还表现出优异的生物相容性，显著促进了成纤维细胞的增殖和迁移，这突显了这种修饰的关键作用。本研究建立了一种生产生物活性胶原蛋白的策略，并强调了羟基化对胶原蛋白稳定性和功能的重要性。

引言

胶原蛋白是人体中一种关键的结构和功能蛋白，它支撑器官、保护组织，并对修复过程至关重要[1]、[2]、[3]。然而，通过传统的动物来源提取物来满足这一巨大需求面临诸多挑战，包括供应链限制和免疫原性风险[4]。预计到2025年，全球胶原蛋白市场将达到66.3亿美元，这推动了对安全高效重组替代品的需求[5]。III型胶原蛋白对于伤口愈合和组织修复至关重要，它作为初始信号激活血小板并启动内源性凝血途径中的凝血因子级联反应[6]。所有类型的胶原蛋白都包含独特的Gly-X-Y三肽重复序列，其中Y位置的羟脯氨酸对于维持三螺旋结构至关重要[7]、[8]。

大肠杆菌是异源蛋白表达的优良宿主；然而，由于缺乏内源性羟化酶，大肠杆菌中羟基化胶原蛋白的生产效率受到限制[9]。Rutschmann等人通过共表达伪病毒的脯氨酸4-羟化酶（P4H）和人类III型胶原蛋白，在大肠杆菌中实现了0.09 mg/mL的羟基化胶原蛋白产量，从而提高了其稳定性[10]。炭疽杆菌的P4H（BaP4H）能够靶向Y位置的脯氨酸残基，并且与人类P4H具有相似的胶原蛋白肽结合亲和力[11]、[12]。Liu等人之前报道了BaP4H与分子量为120 kDa的人类I型与III型胶原蛋白嵌合体的共表达，得到了羟基化率为63.6%的重组胶原蛋白类似物[13]。然而，仍然存在的低羟基化效率和产物高分子量问题可能会影响产品质量，因此需要全面的生物活性评估。

尽管大肠杆菌已被用于生产类胶原蛋白，但它仍存在一些缺点，包括由于细菌内毒素的高含量可能导致宿主免疫排斥。相比之下，大肠杆菌 Nissle 1917 (EcN)是一种具有非免疫毒性、抗炎活性和调节肠道菌群的益生菌，在工业应用中具有巨大潜力[14]。与用于蛋白质表达的传统大肠杆菌 K-12衍生物（如大肠杆菌 BL21）不同，EcN的低内毒性是其遗传特性决定的。正如文献中广泛报道的[15]，EcN由于参与核心寡糖生物合成和O-抗原连接的基因突变，含有粗糙型脂多糖（LPS）。这种结构不完整的LPS通过减弱TLR4/MD-2复合物的激活能力，显著降低了免疫刺激作用[16]。Ma等人通过基因工程改造EcN使其分泌胰高血糖素样肽1，从而在高脂饮食的小鼠中减少了体重和食物摄入[17]。因此，EcN已成为一种潜在的重组蛋白表达的生物安全宿主。

尽管对重组胶原蛋白的研究兴趣日益增加，但仍存在许多技术挑战。如表1所示，之前在大肠杆菌系统中生产胶原蛋白的尝试仍面临翻译后修饰缺失、羟基化率低（例如10%[18]）和内毒素污染等问题。相比之下，酵母和哺乳动物系统虽然提供了更好的蛋白质加工效果，但成本更高且产量较低，因此优化系统选择和纯化方案（如结合亲和层析和内毒素去除步骤）对于平衡产量、纯度、生物活性和可扩展性至关重要。本研究通过计算机辅助筛选，采用了优化的EcN和BaP4H共表达途径，并评估了产品特性，从而克服了重组胶原蛋白的局限性，旨在开发出兼具高羟基化效率和优异生物活性的安全重组胶原蛋白产品。

部分内容

介质、菌株和培养条件

本研究中使用的细菌菌株、质粒和引物详见表S1。所有大肠杆菌菌株及其重组衍生物均在220 rpm的摇床中用Luria-Bertani (LB)培养基培养，无需额外氧气控制。LB培养基由10 g/L色氨酸（OXOID，英国）、5 g/L酵母提取物（OXOID，英国）和10 g/L NaCl组成。最终添加了100 μg/mL氨苄西林（BBI生命科学，中国）和0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG；纯度≥99%，Diamond，中国）。

重组人类III型胶原蛋白类似物的表达

为了模拟胶原蛋白的天然结构，我们基于人类COL3A1基因的核心序列（残基579-608）设计了一系列串联重复肽。生成了含有四个（r4）、八个（r8）和十六个（r16）重复的构建体。AlphaFold2建模预测所有构建体都采用了稳定的螺旋状构象，且无论重复次数如何都能保持结构完整性（图1A）。在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达并纯化后，进行了SDS-PAGE分析。

结论

总之，我们利用益生菌EcN建立了一个高产功能性人类III型胶原蛋白类似物R8的生物合成平台。该系统的主要创新在于其能够最小化内毒素引起的免疫原性（图7）。通过计算筛选和串联重复设计，R8被改造以包含整合素结合基序GLOGEN，并通过与...的共表达实现了60%的羟脯氨酸含量

资助

作者衷心感谢华东师范大学生命科学学院仪器共享平台和美超医疗器械有限公司（海宁，中国）的支持。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

所有作者均声明没有利益冲突或需要披露的利益关系。

CRediT作者贡献声明

刘唐琳：验证、方法学、数据管理。张静：验证、方法学、正式分析、数据管理。郑丽辉：可视化、方法学、数据管理。黄静：写作 – 审稿与编辑、写作 – 初稿撰写、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。赵文静：数据管理、正式分析、方法学、可视化。郑正：写作 – 审稿与编辑、写作 – 初稿撰写、可视化、验证，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益冲突或个人关系。