使用一种阳离子BODIPY衍生物来根除细胞内外及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），同时几乎不会导致细菌产生抗药性

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Eradicating extra- and intra-cellular Staphylococcus aureus and MRSA with little accumulation of resistance by a cationic BODIPY derivative

金黄色葡萄球菌（S. aureus）尤其是耐甲氧西林菌株（MRSA）的耐药性问题突出。本研究设计合成TPAMe-BODIPY化合物，其双“Y”形结构含4个阳离子基团，可高亲和力结合细菌DNA，激活SOS应答并快速产生活性氧（ROS），从而同时杀灭胞内外的S. aureus和MRSA，杀菌效果优于传统抗生素（如庆大霉素和氨苄西林），且连续20天低浓度孵育未诱导耐药性。其多靶点ROS生成机制可有效抑制耐药性发展。

　　

刘秀莲|达旭文|吴尧|徐云丽|史宇|吴爱凤|邹新月|杨玲清|关鸿峰|王学松|周倩雄

中国科学院物理化学技术研究所光化学转化与光电材料重点实验室，北京 100190，中国

摘要

金黄色葡萄球菌（S. aureus），尤其是耐药菌株，已成为致命细菌感染的主要原因之一。迫切需要新型抗菌剂，这些抗菌剂能够在长期使用过程中有效消灭耐药病原体而不会轻易诱导耐药性。本研究设计并合成了一种具有高DNA结合亲和力的TPAMe-BODIPY，以实现这一目标。由于其两个带有四个正电荷的“Y”形结构，TPAMe-BODIPY能够牢固地结合细菌DNA，并激活病原体的“拯救我们的灵魂”（SOS）反应，从而迅速产生大量活性氧（ROS）。抗菌实验表明，TPAMe-BODIPY能够在体外和体内有效消灭细胞外和细胞内的S. aureus以及耐甲氧西林的S. aureus（MRSA），其效果优于传统的抗生素庆大霉素和氨苄西林。更重要的是，在亚致死浓度下连续培养20天后，S. aureus细胞并未表现出明显的耐药性，这可能是由于ROS的多靶点抗菌机制所致。这些结果为开发新型抗菌剂以对抗日益严重的耐药性问题提供了新的思路。

引言

金黄色葡萄球菌（S. aureus）已成为肺炎、菌血症、心内膜炎和骨髓炎等致命细菌感染的主要原因[1],[2]。耐药菌株（如耐甲氧西林的S. aureus（MRSA））的出现和快速传播进一步加剧了全球范围内的临床挑战和公共卫生问题[3],[4]。除了抗生素耐药性外，S. aureus还能侵入并存活于哺乳动物细胞内，形成细胞内细菌（ICB）[5],[6],[7],[8]。宿主细胞可以保护ICB免受常见抗生素的清除和杀菌作用，从而导致慢性及复发性感染[9],[10],[11],[12],[13],[14]。为了增强对ICB的抗菌效果，已有研究报道基于纳米颗粒或肽-抗生素 conjugates 的抗菌递送系统能够增加抗生素在细胞内的积累[15],[16],[17],[18],[19]。

临床可用的抗生素主要通过靶向关键的大分子生物合成过程来发挥杀菌作用，包括抑制细胞壁和蛋白质的合成，以及干扰DNA复制或转录[20],[21],[22],[23],[24],[25]。传统抗生素的单一靶向抗菌机制容易导致病原体快速产生耐药性[26]。因此，具有独特多靶点作用机制的新型合成抗菌剂更为理想。值得注意的是，通过破坏细菌细胞膜发挥作用的抗菌剂诱导耐药性的风险较低[27],[28],[29]。此外，先前的研究表明，与细菌DNA的强相互作用可以激活病原体的“拯救我们的灵魂”（SOS）反应，从而迅速产生大量活性氧（ROS）[30],[31],[32],[33]。ROS会对细菌成分造成非选择性损伤，因此病原体难以对这种作用机制产生耐药性。

最近，刘教授和毛教授报道了一种新型的核靶向化合物（MeTPAE），其两个臂上延伸了带正电荷的吡啶基团，形成“Y”形结构[34]。MeTPAE可通过电子相互作用和ππ堆积与DNA牢固结合，在光动力治疗后表现出高效的抗癌活性。与哺乳动物细胞相比，细菌DNA几乎“裸露”，缺乏核膜的保护，这使得开发针对DNA的抗菌剂变得更加容易。基于这些考虑，本文设计并合成了一种具有高DNA结合亲和力的抗菌剂——TPAMe-BODIPY（图1）。TPAMe-BODIPY具有疏水核心和两个带有四个正电荷吡啶基团的“Y”形结构。这些阳离子基团有助于其与带负电荷的细菌膜和DNA的牢固结合，而疏水核心则有助于其有效穿过细胞质膜[36]。详细实验结果表明，TPAMe-BODIPY能够高效杀死细胞外和细胞内的S. aureus及MRSA，其效果优于传统抗生素庆大霉素和氨苄西林。此外，TPAMe-BODIPY不仅能够迅速发挥杀菌作用，还能有效清除S. aureus的持久存在细胞。最重要的是，在亚致死浓度下连续培养20天后，未观察到明显的细菌耐药性。机制研究表明，TPAMe-BODIPY能够牢固结合DNA，导致大量ROS的产生，进而破坏细菌膜。其他一些BODIPY衍生物也被报道可以通过光诱导ROS的产生来杀死病原体[37],[38],[39]，这属于众所周知的抗菌光动力疗法（aPDT）。尽管aPDT在克服耐药性方面也显示出潜力，但其临床应用受到外部光照激活的限制，通常组织穿透深度较浅。当前的结果（无需外部光照即可产生ROS）为开发新型抗菌剂以对抗日益严重的耐药性问题提供了新的思路。

分子设计与合成

除了TPAMe-BODIPY外，还合成了不含阳离子基团的TPA-BODIPY作为对照（图1A）。两种化合物的合成路线见图S1。所有化合物均通过¹H NMR（核磁共振光谱）、HR ESI-MS（高分辨率电喷雾离子化质谱）和HPLC（高效液相色谱）进行了表征（图S1–S10）。TPAMe-BODIPY和TPA-BODIPY在650–800 nm范围内有强吸收

结论

本研究设计并合成了TPAMe-BODIPY以对抗日益严重的耐药性问题。由于其两个带有四个正电荷的“Y”形结构，TPAMe-BODIPY具有较高的DNA结合常数（K = 9.3 × 10⁷ M^-1），甚至高于经典的DNA插入剂[Ru(bpy)₂(dppn)]²⁺（K = 4.0 × 10⁷ M^-1）[45]。TPAMe-BODIPY与细菌DNA的结合会导致大量ROS的产生，从而表现出强效的抗菌作用

材料

β-丙氨酸、碘甲烷、六氟磷酸铵、三氟乙酸、三氯(苯)硅烷、三乙胺、三氟化硼二乙醚购自Acros和Tci。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京BioDee生物技术有限公司。细菌活力染色试剂盒（N,N-二甲基苯胺N-氧化物/碘化丙啶，DMAO/PI）购自碧云天。磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1 mM，pH=7.4）和新鲜兔红细胞也用于实验

作者贡献声明

关鸿峰：正式数据分析。王学松：撰写 – 审稿与编辑、方法学、实验设计、资金获取、正式数据分析、概念构思。周倩雄：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、方法学、实验设计、资金获取、正式数据分析、概念构思。刘秀莲：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、监督、软件使用、资源协调、项目管理、方法学、实验设计、正式数据分析

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）（22371289）的资助。