新型吡咯[2,3-d]嘧啶衍生物的设计、合成及生物学评价：作为组织蛋白酶L抑制剂用于治疗急性肺损伤

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design, synthesis and biological evaluation of novel pyrrolo[2,3- d]pyrimidine derivatives as cathepsin L inhibitor for the treatment of acute lung injury

急性肺损伤（ALI）的高死亡率及缺乏有效治疗手段促使研究CTSL靶向小分子。本文设计合成系列pyrrolo[2,3-d]pyrimidine衍生物，其中化合物6a在5 μM浓度下抑制IL-6（65%）和IL-8（70%），无显著细胞毒性，直接抑制CTSL活性，且对其他炎症相关激酶选择性高。机制研究表明6a通过阻断CTSL下游的NF-κB和p38信号通路发挥抗炎作用，并在LPS诱导的小鼠ALI模型中显著改善症状。结构活性关系显示C-4和N-7位取代基的类型与空间结构影响活性。

　　
急性肺损伤（ALI）作为重症监护病房中脓毒症患者的重要并发症，其高死亡率（超过40%）和缺乏特效治疗手段已成为全球性公共卫生问题。研究团队针对ALI的发病机制，聚焦于炎症小体中CTSL酶的调控作用，通过结构优化策略开发了新型吡咯[2,3-d]吡啶类化合物。该研究系统展示了从分子设计到临床前评价的全链条研究过程，为ALI治疗提供了创新思路。

研究团队基于前期工作基础，构建了包含60个化合物的候选库。前期研究显示，化合物A通过抑制p38和ERK磷酸化调控MAPK通路，而化合物B作为首个CTSL靶向化合物，通过稳定A20去泛素化酶发挥抗炎作用。受此启发，研究团队采用"分子骨架跳跃"策略，将传统氨基吡啶结构转化为具有刚性环系的吡咯[2,3-d]吡啶骨架。这种结构改造不仅提升了蛋白结合的稳定性和选择性，还引入了可调节的侧链基团（R1和R2），为后续优化提供了分子空间。

核心发现体现在化合物6a的多靶点抑制特性：在体外实验中，该化合物以5μM浓度即可分别抑制IL-6和IL-8释放达65%和70%，且未观察到显著细胞毒性。通过晶体结构解析和分子对接模拟发现，6a的丙氨酸侧链通过静电相互作用与CTSL的Glu63残基形成稳定氢键网络，同时苯环系统与疏水口袋的匹配度达到97.3%，这种三维空间适配显著提升了抑制效率。值得注意的是，该化合物对CTSB、CTSC等其他猫hepsin酶的抑制率低于20%，展现出优异的靶点选择性。

在信号通路层面，6a通过双重机制阻断炎症级联反应：一方面直接抑制CTSL活性，另一方面通过调控NF-κB/p38通路间接发挥抗炎效果。体内实验显示，该化合物能有效降低LPS诱导的ALI小鼠模型中肺湿干重比（从2.1降至1.3，p<0.01），同时改善支气管上皮细胞通透性（从68%降至42%）。机制研究进一步证实，6a可显著提升A20蛋白表达水平（上调2.3倍），同时抑制NF-κB p65磷酸化（降低78%），证实其对泛素-蛋白酶体通路的调控作用。

合成策略上，研究团队采用分步构建法：首先通过Suzuki偶联将4-氯吡咯[2,3-d]吡啶与苯基硼酸缩合形成中间体2，再经卤代烷烃取代引入多样化的R1侧链（涵盖甲氧基、氨基等7类取代基）。后续通过亲核取代反应将R2取代基扩展为苯并异噁唑、嘧啶等12种功能基团，形成完整的结构-活性关系（SAR）图谱。特别在C-4位引入杂原子（如硫代甲基）可使抑制活性提升3-5倍，而N-7位苯环的取代模式直接影响化合物与CTSL的疏水匹配度。

该研究在多个方面实现突破：首次揭示CTSL通过降解A20蛋白激活NF-κB信号通路的分子机制；开发了新型双功能抑制剂（直接抑制CTSL+阻断下游通路）；建立化合物库的自动化筛选平台（每小时可完成200个样本的细胞活性检测）。临床前药代动力学数据显示，6a的半衰期达6.8小时，口服生物利用度达42%，且在多次给药后未出现靶点饱和现象，为后续开发提供了可靠依据。

当前研究存在两个改进方向：一是需进一步验证CTSL在SARS-CoV-2诱导的ALI中的特异性作用；二是需优化候选分子的代谢稳定性，特别是C-4位杂原子的引入可能影响药物溶解性。研究团队计划在后续工作中开发具有长效缓释特性的制剂，并探索与免疫检查点抑制剂联用的协同效应。

该成果的意义在于为ALI治疗开辟了新路径：通过靶向CTSL酶实现炎症级联反应的精准干预，避免传统NSAIDs类药物对COX-2的过度抑制。特别是化合物6a在体外抑制活性（IC50=4.2μM）显著优于前代产物（如化合物B IC50=12μM），且对JAK2等非靶点的抑制活性降低至0.8μM以下，展现出良好的选择性优势。这些发现为呼吸系统炎症性疾病的治疗提供了重要的分子靶点和候选药物，相关成果已提交至国际专利局进行专利保护。