利用两种促进复苏的因子，针对杂交蛇头鱼（Channa maculata ♀ × Channa argus ♂）中的Nocardia seriolae开发亚单位疫苗

《Fish & Shellfish Immunology》：Develop subunit vaccines against Nocardia seriolae in hybrid snakehead ( Channa maculata ♀ × Channa argus ♂) using two resuscitation-promoting factors

鱼诺卡氏病是由Nocardia seriolae引起的主要细菌性病害，对水产养殖造成严重经济损失。本研究通过原核表达获得N. seriolae ZJ0503的RpfB和RpfD蛋白，结合弗氏不完全佐剂制成亚单位疫苗。实验表明，疫苗能有效提高杂交鲈鱼的存活率，增强血清中非特异性免疫指标活性，促进特异性抗体IgM和免疫相关基因（如tnfα、il-1β等）的表达，证实其安全性和有效性，为鱼类诺卡氏病防控提供了新策略。

　　

宁德宇|杨慧媛|李燕|李宇豪|何强才|文一鸣|夏立群

广东省水生动物健康评估工程技术研究中心，深圳海洋大学海洋经济动物苗种评价公共服务平台，中国广东省深圳市

摘要

鱼诺卡菌病是水产养殖中的一种细菌性疾病，Nocardia seriolae是其主要病原体。预防和治疗N. seriolae感染面临多重挑战，例如慢性感染的机制尚不明确、该菌具有抵抗吞噬细胞杀灭的能力，以及抗生素的治疗效果不佳。促复苏因子（Rpfs）在革兰氏阳性细菌中广泛存在，并已被报道可作为结核病和诺卡菌病的候选疫苗。在本研究中，通过原核表达获得了N. seriolae ZJ0503的RpfB和RpfD蛋白，并分别将其与弗氏不完全佐剂（FIA）结合制成亚单位疫苗。最终在杂交鲶鱼中评估了这些疫苗的效果。结果显示，RpfB+FIA和RpfD+FIA亚单位疫苗的相对存活率分别为77.78%和70.37%。组织病理学检查表明，腹腔注射RpfB+FIA和RpfD+FIA疫苗后，杂交鲶鱼未出现细胞毒性反应。此外，这两种疫苗均提高了鱼血清中多种非特异性免疫参数（如LYZ、CAT、ACP、AKP和SOD）的活性。与对照组相比，特异性抗体（IgM）的产生以及免疫相关基因（tnfα、il-1β、cd4、cd8α、mhciα和mhciiα）的表达也显著增强。总之，RpfB和RpfD亚单位疫苗安全有效，能够保护杂交鲶鱼免受N. seriolae感染，是预防鱼诺卡菌病的理想候选疫苗。

引言

鱼诺卡菌病主要由Nocardia seriolae引起，是水产养殖中的一种流行性细菌性疾病，导致严重的经济损失。N. seriolae可感染40多种鱼类，包括海水鱼类（Trachinotus ovatus、Larimichthys crocea、Lateolabrax japonicus和Anguilla japonica）和淡水鱼类（Channa argus和Micropterus salmoides），显示出其广泛的宿主范围和复杂的感染机制[1]。N. seriolae是一种兼性细胞内革兰氏阳性病原体，在感染过程中可被脾脏和头肾等免疫器官中的吞噬细胞吞噬。该菌已进化出逃避吞噬细胞杀灭的机制，并能在吞噬细胞内存活[2]。随着吞噬细胞的迁移，存活的N. seriolae可以在宿主组织中扩散、繁殖并形成肉芽肿（白色结节）[3]。对于肉芽肿内的N. seriolae来说，结节结构可作为抵御宿主免疫系统和抗生素杀灭的屏障。张等人开发了一种针对磷酮醇酶家族蛋白的DNA疫苗（pcDNA-pk），可引发强烈的免疫反应[4]。此外，刘等人构建了一种来自丙氨酸脱氢酶基因敲除株ΔNsAld的减毒活疫苗，该疫苗的毒力降低，对N. seriolae的防护效果增强[5]。疫苗是控制鱼诺卡菌病的一种有前景策略[6]。促复苏因子（Rpfs）最初由Mukamolova从Micrococcus luteus中分离得到[7]，是一种能够使存活但无法培养（VBNC）细胞复苏的关键生长因子。在皮摩尔浓度下，Rpfs通过自分泌或旁分泌信号促进细菌生长，适用于多种革兰氏阳性菌属，包括Micrococcus、Mycobacterium、Corynebacterium、Nocardia、Streptomyces、Rhodococcus和Actinomyces[7]、[8]、[9]、[10]。Rpfs分为分泌蛋白和细胞壁相关蛋白两类，是疫苗开发的潜在候选物质。Kondratieva等人通过删除rpf基因构建了M. tuberculosis的减毒株，制备了活减毒疫苗[11]。对于N. seriolae，Hoang等人报告称，Rpf蛋白与商业佐剂Montanide? ISA 763 A VG联合使用在鲈鱼中的保护率为69.23%[12]。

本研究从N. seriolae ZJ0503菌株中鉴定出四种Rpfs（rpfA-D），并选取RpfB和RpfD作为代表候选蛋白，开发亚单位疫苗进行免疫保护研究并评估其疫苗应用效果。

杂交鲶鱼和N. seriolae ZJ0503菌株的培养方案

无疾病的杂交鲶鱼（Channa argus ♀ × Channa maculate ♂），体重25 ± 5克，体长13 ± 2厘米，购自中国阳江的一家商业渔场。这些鱼被运输到广东海洋大学海洋生物学研究基地（湛江）进行适应训练。它们被置于25 ± 0.2°C的循环淡水中饲养，试验前两周每天喂食相当于体重3%的商业饲料。

Rpf蛋白的氨基酸理化性质、结构特征和同源性预测

通过分析N. seriolae ZJ0503菌株的全基因组数据，鉴定出四种Rpfs同源物（RpfA-D）。使用ExPASy和DNAMAN5.0软件预测了N. seriolae中Rpfs的理化性质（氨基酸长度、分子量、等电点）。rpfA编码210个氨基酸（pI 6.26），rpfB编码382个氨基酸（pI 5.81），rpfC编码111个氨基酸（pI 7.84），rpfD编码182个氨基酸（pI 4.91）。所有Rpfs蛋白均含有一个保守的转糖基化结构域

讨论

近年来，鱼诺卡菌病已在49个国家和地区被报道，给全球水产养殖业造成了重大经济损失[1]。这种由N. seriolae引起的系统性、慢性、肉芽肿性疾病是养殖鱼类中最常见的细菌感染之一[21]。多项研究表明，传统的灭活疫苗（甲醛灭活或热灭活）未能有效预防N. seriolae感染[22]

CRediT作者贡献声明

宁德宇：方法学设计、实验实施、初稿撰写、数据分析、结果验证、可视化处理。杨慧媛：方法学设计、实验实施、数据分析、结果验证。李燕、李宇豪和何强才：方法学设计、实验实施、结果验证。文一鸣：数据分析、结果验证、文章撰写与编辑。夏立群：项目构思、资金筹措、文章撰写与编辑。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

利益冲突声明

所有作者声明本研究过程中不存在任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。

致谢

我们感谢所有实验室成员对改进稿件的宝贵建议。本研究得到了广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515012674；2024A1515010074）、广西重点研发计划（Guike nong AB2506910041）以及广东省高校重点领域专项项目（2023ZDZX4008）的支持。