探索人畜源Bacteroidota菌株：抑制病原生物膜与群体感应淬灭功能的新发现

《microLife》：Exploring Bacteroidota Strains from Human Stool and Animal Feces: Phenotyping and Functional Diversity

本研究针对病原菌生物膜形成和抗生素耐药性问题，系统分离了42株人畜源拟杆菌门菌株，通过高通量筛选发现其细胞提取物可显著抑制金黄色葡萄球菌(抑制率高达69%)和表皮葡萄球菌(抑制率高达82%)的生物膜形成，并首次报道了14株菌具有群体感应淬灭(QQ)活性。该研究为开发针对耐药病原菌的微生态干预策略提供了新的菌种资源。

　　

在微生物组研究日益深入的今天，肠道菌群中的拟杆菌门(Bacteroidota)成员因其在宿主健康中的重要作用而备受关注。然而，对于这类细菌如何通过直接对抗病原菌、干扰其致病机制来发挥益生功能，我们仍知之甚少。特别是，病原菌通过形成生物膜(biofilm)来抵御抗生素和宿主免疫攻击，是导致慢性感染和抗生素耐药性危机的重要原因。开发能够精准破坏病原菌生物膜形成、而不扰乱有益菌群的新策略，成为当前微生物治疗领域的迫切需求。

为了填补这一知识空白，来自德国基尔大学的研究团队在《microLife》上发表了最新研究成果。他们从健康人粪便以及小鼠、马、乌龟等多种动物粪便样本中，成功分离并鉴定了42株拟杆菌门菌株，涵盖拟杆菌纲(Bacteroidia)和鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)。研究人员对这些菌株进行了系统的功能表征，重点探究了它们抑制五种世界卫生组织(WHO)列出的重要临床病原体（包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌¹和表皮葡萄球菌²、革兰氏阴性菌产酸克雷伯菌³和铜绿假单胞菌⁴，以及真核生物白色念珠菌⁵）生物膜形成的能力。此外，还评估了菌株的胆汁盐水解酶(BSH)活性以及群体感应淬灭(QQ)活性，这些功能与菌株在肠道内的定植适应、微生物群落互作及宿主-微生物相互作用密切相关。

研究采用了几项关键技术方法：通过16S rRNA基因测序进行菌株的系统发育分析和鉴定；使用96孔板结晶紫染色法进行高通量生物膜抑制活性筛选；利用定制微流控流动池系统结合激光共聚焦显微镜(CLSM)对选定菌株的生物膜抑制效果进行可视化验证和定量分析；采用特异性报告菌株检测菌株提取物对酰基高丝氨酸内酯(AHL)和自诱导剂-2(AI-2)这两种群体感应信号的淬灭活性；通过平板扩散法观察胆汁酸解偶联带来的沉淀圈以评估胆汁盐水解酶活性。样本来源包括健康人粪便（经伦理批准并获知情同意）以及小鼠盲肠内容物和其他多种动物粪便。

3.1. 来自动物和人类样本的拟杆菌门菌株的多样性和鉴定

研究人员从人粪便、小鼠盲肠及其他动物粪便样本中，通过选择性及非选择性厌氧培养基进行富集和分离，最终获得了42株拟杆菌门菌株。通过全长16S rRNA基因序列分析，这些菌株被鉴定为7个不同的物种，包括Bacteroides caecimuris、Bacteroides fragilis、Bacteroides muris、Bacteroides ovatus、Bacteroides xylanisolvens、Phocaeicola sartorii以及Sphingobacterium multivorum。系统发育分析显示，这些菌株并未严格按其宿主来源（如人、小鼠）进行聚类。

3.2. 大多数新的拟杆菌门菌株显示出生物膜抑制活性

对42株菌的培养上清液和不同分子量（>10 kDa, 3-10 kDa, <3 kDa）的细胞提取物组分进行筛选发现，共有116个样品对至少一种病原体的生物膜形成表现出显著抑制（≥20%）。其中，34个上清液样品和36个>10 kDa的组分显示出抑制效果。抑菌谱分析表明，多数测试样品对革兰氏阳性病原体（金黄色葡萄球菌，40个样品；表皮葡萄球菌，82个样品）的抑制效果尤为突出，而对铜绿假单胞菌（7个样品）和白色念珠菌（6个样品）有抑制活性的样品相对较少。抑制率最高分别可达69%（金黄色葡萄球菌）和82%（表皮葡萄球菌）。

3.3. 三种选定的拟杆菌门菌株(241155E, 241170E 和 241174E)在微流控流动池中对产酸克雷伯菌和表皮葡萄球菌生物膜形成的影响

基于初筛结果，研究人员选取了抑制效果显著的三株菌——B. muris 241155E、B. fragilis 241170E 和 B. caecimuris 241174E，利用微流控流动池系统进一步验证其生物膜抑制效果。激光共聚焦显微镜分析显示，在添加了0.5%的241155E或241174E细胞提取物后，产酸克雷伯菌形成的生物膜厚度和体积均显著降低，仅形成微菌落而非对照组中观察到的致密波浪状结构。同样，241155E和241170E的细胞提取物也能强力抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，使其生物膜体积降至对照组的9%-15%。这些结果与结晶紫法的初筛结果一致，证实了这些拟杆菌菌株在控制病原菌生物膜方面的巨大潜力。

3.4. 拟杆菌门菌株的群体感应淬灭作用

群体感应淬灭活性检测发现，在42株测试菌株中，有5株显示出AHL淬灭活性，13株显示出AI-2淬灭活性。AHL淬灭活性仅存在于细胞提取物中，而AI-2淬灭活性主要在细胞提取物中检测到，也有3株菌的上清液中存在该活性。值得注意的是，菌株241155E、241159E、241174E和241191E同时对AHL和AI-2具有淬灭活性。然而，拥有QQ活性的菌株并非总能抑制所有病原体的生物膜形成，提示QQ抑制剂的浓度或病原体复杂的QS系统（如铜绿假单胞菌拥有三套QS系统）可能影响最终效果。

3.5. 拟杆菌门菌株显示胆汁盐水解活性

胆汁盐水解酶活性测试表明，绝大多数菌株（39/42）都具有BSH活性，仅有3株菌（241155E, 241158E, 241196E）未检测到活性。BSH酶能够解偶联胆汁盐，产生游离胆汁酸，这不仅影响细菌在肠道内的存活和定植，也参与调节胆汁酸代谢和肠道微生物组的组成。

本研究系统地揭示了从不同宿主分离的拟杆菌门菌株，特别是拟杆菌纲和鞘脂杆菌纲成员，在抑制病原菌生物膜、淬灭群体感应以及水解胆汁盐方面具有丰富的功能多样性。研究结果表明，像B. muris 241155E和B. caecimuris 241174E这样的菌株，兼具强效的生物膜抑制和QQ活性，是开发抗生物膜干预措施的理想候选菌株。而B. fragilis 241170E等菌株则同时具备生物膜抑制和BSH活性，在调节肠道菌群和代谢健康方面可能具有双重优势。

值得注意的是，具有QQ活性的菌株多数分离自小鼠盲肠等竞争激烈的生态环境，暗示此类功能可能是在复杂微生物群落中进化出的竞争优势。尽管拟杆菌门细菌，尤其是拟杆菌纲，是肠道菌群的核心成员，但对其菌株特异性功能，特别是直接拮抗病原体的机制，仍缺乏深入理解。病原菌生物膜是导致慢性感染（如炎症性肠病IBD）和治疗失败的关键因素，而WHO已将对碳青霉烯类等最后防线抗生素耐药的克雷伯菌属、葡萄球菌属等列为亟需新型抗菌药物的优先病原体。因此，本研究发现的具有抗生物膜和QQ活性的拟杆菌门菌株，为开发针对性强、不易产生耐药性、且能维持肠道微生态平衡的下一代益生菌或微生物疗法提供了重要的资源库和理论依据。未来研究需要通过全基因组测序、泛基因组分析等手段进一步解析这些功能背后的遗传基础，并通过体内实验验证其有效性和安全性，最终推动其向临床应用转化。