来自枯草芽孢杆菌ALP E1的嗜酸脂肪酶的部分纯化与特性分析

《Protein Expression and Purification》：Partial purification and characterization acidophilic lipase from Bacillus cereus ALP E1

微生物脂酶研究：从Bacillus cereus ALP E1中分离并纯化外源酸性脂酶，硫酸铵分级纯化后活性达31083.14 U/mg，SDS-PAGE显示单一条带55 kDa，最适pH 5、40°C，氯仿激活且吐温80抑制，为工业催化提供新资源。

　　

Nindy Novita Sari | Nurhasanah | Titin Haryati

印度尼西亚万隆市兰蓬大学数学与自然科学学院化学硕士课程

摘要

新型微生物脂肪酶的发现至关重要，因为其在工业领域有多种应用。Bacillus cereus是一种具有潜在脂肪酶来源的菌株。迄今为止，从Bacillus cereus中探索新的脂肪酶的工作仍然有限。本研究旨在从Bacillus cereus ALP E1菌株中提取脂肪酶，并对其产生的脂肪酶进行纯化和表征。本研究从印度尼西亚兰蓬省Panjang港的海水中分离出Bacillus cereus ALP E1的胞外嗜酸脂肪酶，并对其进行了部分纯化和表征。通过 submerged 发酵法生产胞外脂肪酶，然后利用硫酸铵分级和透析法进行部分纯化，最终获得了12.31倍的纯化倍数，比活性达到31083.14 U/mg。SDS-PAGE分析显示，纯化的脂肪酶主要成分的分子量为55 kDa。脂肪酶的特性研究表明，其最佳pH值为5，最佳温度为40°C，对底物

-硝基苯基硬脂酸酯（C18）的活性最高。该脂肪酶可被Ba²⁺激活，被Mg²⁺失活。添加1%的Tween 20可以增强其活性，而Tween 80则会使其失活。所有测试的有机溶剂在5%浓度下都能激活脂肪酶，其中使用氯仿优化后的激活效果最佳。结果表明，海水是发现高活性脂肪酶的有希望的来源。这些完整的表征信息为脂肪酶在工业应用中的使用奠定了基础。

引言

三酰甘油酰基水解酶（EC 3113），也称为脂肪酶，是一种能够将甘油三酯分解为游离脂肪酸和甘油的酶。脂肪酶还参与其他多种生物催化反应，如酯化、酯交换、醇解、胺解和异构化[[1], [2], [3]]。脂肪酶的灵活性使其在食品、制药、化妆品和可再生能源行业中得到广泛应用[3]。目前工业市场上的脂肪酶主要依赖商业来源。然而，酶的供应有限且价格相对较高，这限制了其大规模应用。因此，有必要探索新的、更经济的脂肪酶来源，尤其是来自本地微生物的脂肪酶。来自微生物的脂肪酶因其高稳定性、可控的生产过程和易于获取而成为首选。

已知Bacillus属细菌具有生产脂肪酶的潜力，这些脂肪酶在工业上有多种应用。B. pulmilus WSS5菌株产生的脂肪酶分子量最小，为28 kDa，而其他Bacillus属脂肪酶的分子量约为31.4 kDa。B. methylotrophicus PS3产生的脂肪酶分子量为47 kDa，B. cereus ATA179和B. licheniformis产生的脂肪酶分子量分别为40 kDa和47 kDa。这些脂肪酶已在食品加工废弃物、农业土壤和水热环境中被分离出来并进行了研究[[7], [8], [9]]。先前的研究还表明B. subtilis产生的脂肪酶适用于生物柴油和有机合成[[10,11]]。另一种有潜力的Bacillus相关脂肪酶来源是Bacillus cereus，该菌株能在不同条件下产生高活性的脂肪酶。B. cereus PCSIR NL-37菌株产生的脂肪酶在pH 7和60°C下的活性较高[12]。此外，其他菌株也能产生能在极端条件下（如碱性pH或低温）工作的脂肪酶，这使得它们在更多行业中具有应用价值[13]。本研究通过对本地分离株的脂肪酶进行探索和表征，旨在开发出可用于工业生物催化的脂肪酶。我们之前的研究确定了B. cereus ALP E1作为高脂肪酶活性的候选菌株，该菌株是从Panjang港的海水中分离出来的[14]。实验表明，使用橄榄油作为底物时，该菌株产生的脂肪酶活性为0.16 U/mL；而使用棕榈油厂废水（POME）作为底物时，脂肪酶活性可提高至55.8 U/mL[15,16]。

为了进一步了解这种脂肪酶作为生物催化剂的潜力，需要对其特性进行进一步研究。本研究旨在对B. cereus ALP E1菌株产生的脂肪酶进行部分纯化，然后确定其分子量并表征其催化特性。

材料与方法

本实验使用了从印度尼西亚兰蓬省Panjang港的海水中以及PT Sumber Indah Perkasa公司提供的棕榈油厂废水（POME）中分离出的B. cereus ALP E1菌株。所用材料包括Merck公司的营养琼脂、营养肉汤、Na₂CO₃、NaOH、CuSO₄·5H₂O、Na/K-酒石酸盐、Folin–Ciocalteu试剂、牛血清白蛋白（BSA）、对硝基苯酚、对硝基苯基棕榈酸酯、对硝基苯基辛酸酯、对硝基苯基十二酸酯和对硝基苯基丁酸酯等。

结果与讨论

成功从B. cereus ALP E1菌株中生产并部分纯化了脂肪酶。

B. cereus ALP E1菌株是从Panjang港的海水中成功分离出的本地菌株[14]。在先前的研究中，通过 submerged 发酵法优化了脂肪酶的生产条件：最佳条件为pH 7、8%的棕榈油厂废水（POME）作为生长底物、1%的接种浓度、155 rpm的搅拌速度以及72小时的培养时间。

结论

从B. cereus ALP E1菌株中成功分离出了胞外脂肪酶，并通过硫酸铵分级法进行了部分纯化，纯化倍数达到12.31倍。SDS–PAGE分析显示，该脂肪酶的主要成分分子量在40–55 kDa范围内，这与Bacillus属细菌的脂肪酶特性一致。根据酶的特性分析，该脂肪酶属于酸性脂肪酶，且为嗜中性菌株产生的脂肪酶。

CRediT作者贡献声明

Nindy Novita Sari：负责撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验设计与概念构思。 Nurhasanah：负责修订与编辑、结果验证、项目监督、资源协调、资金筹措及概念构思。 Titin Haryati：负责修订与编辑、结果验证、项目监督、方法设计及数据管理、概念构思。

致谢

N.N.S.衷心感谢在研究过程中给予指导、支持和帮助的各位导师。感谢他们的建议、激励和知识传授，使本研究得以顺利完成。