生成一种能够特异性识别牛病毒性腹泻病毒重组NS5A蛋白的多克隆抗体

《Protein Expression and Purification》：Generation of a polyclonal antibody that specifically recognizes the recombinant NS5A protein of bovine viral diarrhea virus

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS5A蛋白的重组表达及多克隆抗体制备研究。通过克隆BVDV NS5A基因构建重组质粒pET-28a-NS5A，在E.coli中表达并纯化重组蛋白，免疫新西兰白兔获得高滴度（1:819200）特异性抗体，Western blot验证抗体可识别原核及真核表达系统中的NS5A蛋白，为研究其功能及开发诊断试剂奠定基础。

　　

周伟杰|王玉婷|梁少波|胡敬进|庞峰

贵州大学动物科学学院兽医系，贵阳，550025，中国

摘要

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是一种对牛病毒性腹泻（BVD）具有重大经济影响的病原体，对全球养牛业造成了严重损害。虽然已知BVDV的NS5A蛋白对病毒复制至关重要，但其具体功能尚未完全阐明。本研究克隆了NS5A基因，并生成了重组质粒pET-28a-NS5A，用于在大肠杆菌中表达。纯化并重折叠后的重组NS5A蛋白被用于免疫新西兰白兔，产生了特异性多克隆抗体。该抗体被用来检测NS5A蛋白的表达情况。研究结果证实，NS5A蛋白能够在原核系统中成功生产和纯化。在新西兰白兔体内产生的抗NS5A多克隆抗体的滴度高达1:819,200。该抗体能够特异性地检测到在原核和真核系统中表达的NS5A蛋白。由于其高特异性和滴度，这种抗体可能成为研究BVDV致病机制中NS5A功能的宝贵工具，并具有开发诊断试剂和新型控制策略的潜力。

引言

BVD是一种由BVDV引起的急性发热性传染病，给全球养牛业带来了重大经济损失[1,2]。该病主要影响所有年龄段的牛，其中6-18个月大的犊牛最为易感，但也可能感染山羊、绵羊和猪等其他家畜[[3], [4], [5], [6], [7]]。BVDV分为两种生物型：细胞病变型（cp）和非细胞病变型（ncp）。持续感染的（PI）牛是主要的病毒宿主，它们通过唾液、鼻分泌物、粪便和牛奶等体液排出病毒。病毒通过呼吸道和消化道传播，也可通过胎盘传播[[8], [9], [10], [11]]。该病的表现包括生殖障碍、产奶量下降、生长不良以及各种呼吸系统和消化系统疾病[[12], [13], [14]]。

作为黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的成员，BVDV具有约12.3 kb的单链正链RNA基因组，其中包含一个大的开放阅读框，编码一种多聚蛋白，两侧有5′和3′非翻译区（UTRs）[[15], [16], [17], [18], [19]]。这种多聚蛋白经病毒蛋白酶处理后产生四种结构蛋白，包括衣壳蛋白、三种包膜糖蛋白（E^rns, E1, E2）和八种非结构蛋白（N^pro, p7, NS2/3, NS4A, NS4B, NS5A, 和 NS5B）[20,21]。

BVDV的NS5多聚蛋白在病毒复制中起核心作用，并通过蛋白酶作用被切割为成熟的NS5A和NS5B蛋白。小分子配体如大豆苷和青蒿素已被证明可以与NS5B（一种RNA依赖的RNA聚合酶）结合，从而有效抑制BVDV的复制，这证明了NS5B是一个可药用的靶点。尽管NS5A是一种亲水性的磷酸化蛋白，缺乏酶活性，但其在组装病毒复制复合体中的关键支架作用使其成为了一个有吸引力的抗病毒靶点，尽管实现这一目标具有挑战性[[23], [24], [25]]。因此，探索新的治疗策略，如设计用于干扰NS5A功能的生物制剂（例如多克隆或单克隆抗体和纳米抗体），代表了抗病毒研究的一个有前景的方向。在本研究中，我们开发了一种针对NS5A的多克隆抗体，以满足对这种蛋白在BVDV致病机制中功能研究的迫切需求，并为开发高效的诊断试剂和新型控制策略奠定了基础。

实验部分

生物试剂

我们的实验室保存了BVDV VEDEVAC菌株（GenBank登录号：AJ585412.1）。人胚胎肾293T（HEK293T）细胞购自百迪生物科技有限公司（嘉兴，中国），并在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素（Solarbio，北京，中国）的高糖DMEM（Gibco，美国）培养基中培养。具有复制能力的大肠杆菌（E.coli）DH5α和BL21（DE3）菌株购自北京清科生物技术有限公司。质粒pET-28a（+）和pcDNA3.1-3 × Flag-C也一并购买。

pET-28a-NS5A重组质粒的构建

我们扩增了1488 bp的BVDV NS5A基因（图1A），并通过限制性酶切验证了pET-28a-NS5A质粒，观察到约5369 bp的线性pET-28a（+）载体片段和1488 bp的NS5A插入片段（图1B）。

NS5A重组蛋白的表达

在含有pET-28a-NS5A重组质粒的E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，SDS-PAGE分析显示了一条约60 kDa的明显条带（图2A），这与NS5A重组蛋白的预期大小相符。

讨论

本研究通过用纯化的抗原免疫新西兰白兔，生成了针对NS5A蛋白的多克隆抗体。制备的多克隆抗体滴度高达1:819,200。Western blot分析证实它们能特异性地识别在原核和真核系统中表达的NS5A蛋白，且未观察到与其他宿主蛋白的交叉反应。

尽管成功生成了这种多克隆抗体，并且具有特异性识别能力，但...

结论

本研究开发了一种高滴度且特异性的针对BVDV NS5A的多克隆抗体，为研究NS5A在BVDV致病机制中的作用提供了有价值的工具，并为未来诊断试剂和控制策略的开发提供了依据。

作者贡献声明

周伟杰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，可视化，验证。王玉婷：撰写 – 审稿与编辑，验证，方法学设计。梁少波：撰写 – 审稿与编辑。胡敬进：撰写 – 审稿与编辑。庞峰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，资金获取，概念构思。

伦理声明

本实验完全遵守中国的实验动物福利伦理审查标准。贵州大学动物伦理委员会批准了本研究中使用动物（批准编号：EAE-GZU-2024-T190）。

资助

贵州省自然科学基金，资助编号：([2022]093)。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。