《Protein Expression and Purification》：Isolation, purification and identification of major allergens
Cor a 9 and Cor a 14 in hazelnuts
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hazelnut过敏原的纯化方法研究。采用机械研磨、脱脂、蛋白提取等步骤，结合硫酸铵沉淀和离子交换色谱法，成功分离并纯化出Cor a 9和Cor a 14两种主要过敏原，纯度分别达85%和95%，并通过质谱和Western blot验证其免疫原性。该流程设备要求低、操作简便且效率高，为过敏机制研究和诊断工具开发奠定基础。
朱伟超|余华红|张颖|罗启书|宋敏|耿秦|周丽华|吴志华
中国江西省南昌市南昌大学食品科学与资源国家重点实验室，邮编330047
摘要
榛子（Corylus avellana）是一种广泛食用的坚果，具有很强的致敏潜力，分离和纯化榛子中的过敏原对于有效预防和管理榛子过敏至关重要。在这项研究中，通过一系列步骤（包括粉碎、脱脂、蛋白质提取、硫酸铵沉淀、透析脱盐和阴离子交换色谱）从榛子仁中纯化了两种主要过敏原Cor a 9和Cor a 14。实验结果表明，这些过敏原被成功纯化，纯度较高且结构完整，能够与榛子过敏患者的血清发生特异性免疫反应。一次实验可获得超过5毫克的Cor a 14（纯度>95%）和超过1毫克的Cor a 9（纯度>85%）。所建立的纯化方法简单、所需设备少且效率高，为榛子过敏原相关研究奠定了初步基础。总之，我们成功分离并纯化了两种主要的榛子过敏原蛋白Cor a 9和Cor a 14，为研究榛子过敏的致敏机制以及开发诊断工具或低过敏原产品提供了宝贵的材料基础。
引言
食物过敏是由于对无害蛋白质的异常免疫反应引起的，导致针对食物过敏原的免疫球蛋白E (IgE)抗体水平升高[1]。坚果是引发IgE介导的食物过敏反应的强效且常见的过敏原来源，这些反应可能非常严重，有时甚至致命[2]。在美国，与坚果相关的过敏占总人口的约1.1%[3]。坚果的广泛消费和使用，尤其是作为食品成分，带来了一定的食品安全风险[2]。
榛子（Corylus avellana）是最有价值的坚果之一，不仅可作为零食食用，还用于生产各种具有理想口感和香气的食品，如糖果、巧克力制品和烘焙食品[4]。然而，榛子也是与过敏反应最相关的坚果[5]。在欧洲，榛子是导致坚果过敏的主要因素[5]，其发病率约为0.2%[6]。根据意大利儿科过敏学会和免疫学会的一项流行病学研究，坚果是第二大常见过敏原，占所有食物过敏病例的16.7%，其中榛子是40%的坚果过敏病例的主要过敏原[7]。
一些研究[8,9]发现11S球蛋白（Cor a 9）和2S白蛋白（Cor a 14）都是预测儿童榛子过敏的良好指标，而另一些研究则认为Cor a 14更有效[10,11]。有研究表明，当将针对Cor a 14的IgE临界值设定为>0.72 kU/L时，诊断准确性达到87%，这表明Cor a 14是一个更优秀的血清学标志物；同时有9名榛子过敏儿童主要对Cor a 9敏感[12]。因此，Cor a 9和Cor a 14可以作为儿童榛子过敏成分鉴别诊断的重要指标。因此，开发一种简单高效的方法来纯化高纯度的Cor a 9和Cor a 14尤为重要。
虽然有许多蛋白质分离方法，但从天然蛋白质中分离和纯化过敏原蛋白通常存在分离效率低、蛋白质纯度低、仪器成本高以及耗时等问题[13]。Cor a 9最初通过二维凝胶电泳（2D PAGE）分离，并通过Edman测序鉴定[14]。Neil M. Rigby等人[15]使用Superdex S200凝胶渗透色谱纯化了Cor a 9，并使用Con A Sepharose 4B柱去除了杂质Cor a 11。然而，得到的Cor a 9纯度较低，存在明显的杂带，且酸性亚基和碱性亚基未能分离。尺寸排阻色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）被用于分离20.7 kDa的碱性亚基，该亚基被证实是榛子Cor a 9的异构体[16]。Cor a 14最初通过尺寸排阻色谱结合RP-HPLC纯化，随后通过克隆、测序并在大肠杆菌中表达相应基因[17]。Sabine Pfeifer等人[18]结合使用Q Sepharose柱和Mono Q柱，在0-1 M NaCl的线性梯度洗脱条件下初步纯化了Cor a 14，再通过凝胶过滤色谱（GFC）和RP-HPLC进一步纯化，但纯化的过敏原Cor a 14仍存在明显的杂带[19]。
硫酸铵沉淀是一种简单有效的蛋白质分离方法，可用于粗蛋白（CP）提取物的初步分级[20]。阴离子交换色谱可以分离具有不同等电点（pI）的物质[21]。这两种方法所需设备少，操作方便，效率较高。它们的结合应用为开发更简单、更高效的Cor a 9和Cor a 14纯化方案提供了可能性。
因此，本研究通过粉碎和脱脂处理榛子仁以提取CP，然后采用不同的分离方法分离Cor a 9和Cor a 14。纯化的蛋白质通过质谱（MS）鉴定，其免疫反应性通过Western blot (WB)确认，并对其三级结构进行了表征。本研究旨在建立一种方便、设备要求低且产量高的Cor a 9和Cor a 14纯化方法，为后续研究榛子过敏原的结构-功能关系和脱敏处理提供必要的材料。
样本制备
样品制备
选用来自中国山东省德州的新鲜榛子，去除外壳后挑选出完整无损的果仁，并使用研磨机和液氮进行精细研磨。随后，用石油醚对所得粉末进行脱脂。脱脂后的榛子粉（DHP）在-20°C下空气干燥后备用。
榛子CP提取及过敏原的初步分离
榛子CP的提取采用了Wu等人[22]描述的方法，并进行了少量修改。具体操作为：将DHP与20 mmol L?1 Tris-HCl缓冲液（pH值未提及）混合
CP的提取
如图1A所示，Tris-HCl提取法能够分离出多种榛子蛋白。Tris-HCl缓冲液系统具有良好的蛋白质稳定性和高溶解性，先前的研究已证明其能有效保持蛋白质活性[29]。值得注意的是，榛子中的大多数过敏原具有弱酸性。大约55 kDa和14 kDa处的蛋白质条带分别对应于目标过敏原Cor a 9和Cor a 14。
结论
以榛子仁为原料，通过机械研磨、脱脂和提取获得了CP。Cor a 9通过硫酸铵沉淀结合阴离子交换色谱纯化，而Cor a 14则通过直接阴离子交换色谱纯化。该方法可实现榛子过敏原Cor a 14（纯度>95%）和Cor a 9（纯度>85%）的单批生产。蛋白质身份通过LC-MS/MS分析确认。
作者贡献声明
朱伟超：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，软件使用，方法学设计，数据分析。余华红：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，项目管理，数据分析。张颖：方法学设计，数据分析。罗启书：数据分析。宋敏：软件使用，数据分析。耿秦：项目指导，概念构思。周丽华：项目指导，软件使用。吴志华：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，资源准备。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32160540）的资助。
