通过基因工程手段在大肠杆菌中表达牛乳铁蛋白功能片段，并分析其抗菌和抗炎作用

《Protein Expression and Purification》：Analysis of the antibacterial and anti-inflammatory functions of bovine lactoferrin functional fragment expressed in Escherichia coli via engineering

本研究通过基因工程在E. coli中表达牛乳铁蛋白N端功能片段BlfFf，纯化后经胃蛋白酶水解产生抗菌肽，显著抑制LPS刺激的Raw264.7巨噬细胞炎症反应，降低IL-1β、TNF-α等炎症因子表达，并表现出促进细胞生长的弱效应。

　　

Hui Teng|Zizi Ding|Yujie Wang|Xueliang Liu|Xiangshan Tang|Xuewen Zhang

湖南农业大学生物科学与生物技术学院，中国长沙410128

摘要

牛乳铁蛋白是一种天然的铁结合糖蛋白，因其具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎和免疫调节等多种功能而受到广泛关注。在本研究中，通过基因工程方法将乳铁蛋白的功能片段（BlfFf）表达在大肠杆菌中。表达的BlfFf主要以包涵体的形式存在于宿主细胞中。收集包涵体后，通过溶解、复性和进一步的色谱纯化获得了纯化的BlfFf多肽。纯化后的BlfFf在胃蛋白酶水解前未表现出抗菌活性；经胃蛋白酶水解后，其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌（分别属于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌）均显示出明显的抗菌作用。细胞实验表明，该BlfFf能够显著降低LPS刺激的巨噬细胞（Raw264.7）炎症模型中炎症相关基因的表达，显示出显著的抗炎效果。在用BlfFf处理的Raw264.7细胞中，多种促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和iNOS的表达水平显著下降。较低浓度的BlfFf还表现出一定的促进细胞生长的作用。本实验展示了细菌基因工程在表达牛乳铁蛋白肽方面的多种生物活性和功能。

材料

大肠杆菌 BL21(DE3)菌株、pET-BlfFf表达载体以及Raw264.7巨噬细胞均由湖南农业大学基因工程与细胞生物学实验室保存。

Cell Counting Kit-8、FreeZol试剂、HisyGo RT Red SuperMix用于qPCR检测，以及Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix均购自Vazyme Biotech有限公司。

胃蛋白酶（1:3000，猪胃蛋白酶）和氨苄西林均购自Culab Technology有限公司；LPS（sigma, L2880）亦由该公司提供。

BlfFf的生物信息学分析

BlfFf的物理和化学性质

使用ExPASy对蛋白质序列进行分析，结果显示其分子式为C₁₇₀₈H₂₆₈₂N₄₇₂O₄₈₁S₁₉，总原子数为5362个，分子量约为38.9 kDa，理论等电点（pI）为9.3。该蛋白被鉴定为不稳定（不稳定性指数为49.42，属于不稳定蛋白；烷基化指数为80.87）。ProtScale预测表明该蛋白具有亲水性，最低得分为-2.822。

讨论

本研究成功在大肠杆菌中表达了牛乳铁蛋白的N端功能片段（BlfFf），并建立了从包涵体中重新折叠该蛋白的可靠方法。最重要的是，我们证明了所得到的非融合产物具有双重生物活性：它对巨噬细胞具有直接的抗炎作用，并且在胃蛋白酶水解后可生成高效的抗菌肽。将这些发现置于更广泛的背景中进行讨论……

CRediT作者贡献声明

Xiangshan Tang：软件处理；Xueliang Liu：软件处理、数据分析；Yujie Wang：撰写、审稿与编辑；Zizi Ding：软件处理、实验设计；Hui Teng：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据验证、资源获取、实验设计、数据分析；Xuewen Zhang：撰写、审稿与编辑

数据获取

数据可应请求向通讯作者获取。

资助

湖南省教育厅重点项目（18A104）、产业联合项目xczx-2023133、2020kjc-js122

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。