《Protein Expression and Purification》：Systematic optimization for high-level secretory expression of a thermostable zearalenone hydrolase ZENM in
Pichia pastoris
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玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种常见于谷物中的霉菌毒素，对牲畜健康危害显著。本研究通过毕赤酵母（Pichia pastoris）异源表达ZEN水解酶ZENM，采用pre-Ost1-pro-α因子信号肽优化、基因剂量倍增及PDI/SEC12分子伴侣共表达策略，将酶产量从6.70 U/mL提升至72.29 U/mL，增幅达10.79倍。该成果为ZENM工业化生产奠定了基础。
赵世达|周秦|吴玉卓|侯颖|吴琦|李丁|徐建红
河南科技大学食品与生物工程学院，中国洛阳，471000
摘要
玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种常见于谷物中的霉菌毒素，对牲畜健康构成严重威胁。由于其高效性、经济性和能够完全降解该毒素的能力，ZEN水解酶被认为是解毒ZEN污染的关键工具。在这些酶中，ZEN水解酶ZENM因其卓越的热稳定性而成为工业应用的有希望的候选者。在本研究中，ZENM在Pichia pastoris系统中进行了异源表达。该酶在pH 8.0和60°C时表现出最佳活性，并在50–60°C范围内保持了超过90%的相对活性。其动力学参数——表观米氏常数（Km,app）和最大反应速率（Vmax）分别为21.59 ± 7.34 μM和0.031 ± 0.002 μM s?1 mg?1。通过使用pre-Ost1-pro-α因子信号肽，ZENM的产量从6.70 U/mL增加到41.55 U/mL；进一步增加基因剂量后，产量提高到50.87 U/mL。此外，与分子伴侣蛋白PDI和SEC12共表达后，产量分别提高到72.29 U/mL和68.88 U/mL。最终，在摇瓶培养中，ZENM的产量比初始菌株提高了10.79倍。这项研究为推进ZENM的工业应用奠定了坚实的基础。
引言
玉米赤霉烯酮（ZEN）主要污染玉米、小麦和大麦等谷物及其加工副产品[1]。通过与雌激素受体竞争性结合，ZEN会引起一系列毒性效应，包括肝毒性、血液毒性、生殖毒性、遗传毒性和免疫毒性[[2], [3], [4], [5]]。目前的ZEN解毒策略分为物理方法、化学方法和生物方法。然而，物理和化学方法在食品和饲料工业中的应用受到其有限的解毒效率和可能破坏营养成分的局限[6]。相比之下，生物解毒利用微生物或其酶将ZEN转化为毒性较低或无毒的产品。这种方法具有底物特异性、温和的操作条件、高效率和操作简便性，因此具有更广泛的应用前景和更大的经济潜力[7,8]。
迄今为止，已鉴定出四类主要的ZEN降解酶：水解酶、过氧化物酶、漆酶和磷酸转移酶[9]。其中，水解酶由于具有较高的降解效率、明确的机制和明确的晶体结构而被广泛研究。其中一种来自Monosporascus sp. GIB2的水解酶ZENM在60°C时表现出最大活性，并在50–60°C范围内保持超过90%的活性，使其明显优于其他已知的ZEN水解酶。此外，ZENM能有效降解多种ZEN衍生物，如α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉醇，显示出其显著的应用潜力。然而，ZENM的低表达水平仍然是其大规模生产和实际应用的主要瓶颈。
Pichia pastoris
是一种广泛用于异源酶生产的真核宿主，以其严格的调控机制、高表达水平、适合高密度发酵以及具有翻译后修饰能力而闻名[11,12]。该系统已成功用于多种异源蛋白的高效生产[[13], [14], [15], [16]]。此前，我们的团队开发了两种重组质粒pMCO-AOXα [17]和pLD-AOXα [18]，它们利用甲醇诱导的Cre重组酶来介导抗生素抗性基因从酵母基因组中的自我切除。这使得基于Zeocin抗性的多轮迭代整合和选择成为可能。利用这一平台，已经高效表达了多种与畜牧业生产相关的蛋白质，包括植酸酶[17]、纳米抗体[18]和经典猪瘟病毒的E2抗原[19,20]。本研究旨在实现ZEN降解酶ZENM在P. pastoris中的分泌表达，并通过信号肽筛选、基因剂量优化和分子伴侣蛋白共表达等策略系统地提高其产量。这些方法显著提高了表达水平。所建立的方法为表达ZENM的二聚体形式提供了一个有效的系统，为未来这类酶的应用奠定了基础。
菌株、质粒和培养基
我们实验室保存了Escherichia coli DH5α菌株、P. pastoris GS115菌株、用于分泌表达的P. pastoris载体pLD-AOXα以及用于细胞内表达的分子伴侣蛋白表达质粒（pLD-AOX-HAC1至pLD-AOX-SEC12）。
E. coli菌株在Luria-Bertani（LB）培养基（1%（w/v）NaCl、1%（w/v）色氨酸和0.5%（w/v）酵母提取物）中培养。P. pastoris培养使用YPG培养基（2%（w/v）蛋白胨、1%（w/v）甘油、1%（w/v）酵母提取物）。
单拷贝酵母菌株的构建
通过密码子优化和A/T含量控制（避免连续8个以上的A/T序列），在体外合成ZENM基因并将其亚克隆到pLD-AOXα中，生成重组质粒pLD-AOXα-ZENM（图1A）。该质粒被转化到P. pastoris GS115中，并筛选出阳性克隆（G-α-ZENM）。摇瓶培养上清液的SDS–PAGE分析显示了一条约30 kDa的条带（图1B，第1道），与ZENM的理论分子量一致。讨论
ZENM是一种新近发现的水解酶，以其优异的热稳定性而著称。迄今为止，它仅在大肠杆菌（E. coli）中表达，但由于产量低，限制了其在实验室规模研究中的应用。如表4所示，大多数报道的ZEN水解酶的最佳温度范围为35至50°C，只有少数酶在50至60°C之间仍然具有活性。这些主要在大肠杆菌中表达的酶的比活性差异很大。
结论
在这项研究中，我们成功实现了ZEN水解酶ZENM在P. pastoris中的重组异源表达。通过密码子优化、基因剂量优化和分子伴侣蛋白共表达等组合策略，酶的产量从6.70 U/mL显著提高到了72.29 U/mL，提高了10.79倍。这些发现为ZENM的未来大规模生产和实际应用奠定了坚实的基础。
作者贡献声明
赵世达：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，方法学，研究，数据管理。周秦：验证，方法学。吴玉卓：验证。侯颖：形式分析。吴琦：资源获取。李丁：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，数据管理。徐建红：资金筹集。资助
本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFD1301004）、国家自然科学基金（32372454、32202797）、江苏省自然科学基金（BK20220745）和江苏省农业科技创新基金（CX(24)2002）的资助。
