全长hnRNPA2B1的液-液相分离的表达、纯化及其生物物理特性研究

《Protein Expression and Purification》：Expression, purification, and biophysical characterization of liquid-liquid phase separation of full-length hnRNPA2B1

本研究成功表达并纯化全长hnRNPA2B1，通过优化离子强度和pH维持溶解状态。在近生理条件下，发现该蛋白发生液-液相分离，形成动态液态液滴，最终成熟为无定形聚集体。该方法为研究LLPS和蛋白聚集提供了可靠工具。

　　
hnRNPA2B1作为多功能RNA结合蛋白，在mRNA剪接、转运及稳定性中发挥关键作用。近年研究发现其C末端低复杂性结构域（LCD）具有液-液相分离（LLPS）特性，这一特性与应激颗粒等膜less细胞器组装密切相关，同时LCD介导的异常相分离也被认为是神经退行性疾病如als和msp的重要致病机制。本研究通过系统优化表达与纯化策略，首次实现了全长hnRNPA2B1的高纯度可溶性表达，并深入揭示了其LLPS动态过程，为解析RNA结合蛋白的相分离机制提供了重要工具。

在表达体系构建中，研究者采用大肠杆菌原核系统，通过pET-22b载体将SUMO标签与hnRNPA2B1的C末端融合表达。该策略成功克服了LCD导致的蛋白难溶问题，经SDS-PAGE检测显示55kDa特征条带（与预期融合蛋白分子量一致），Western blot验证抗体特异性。值得注意的是，通过调整盐浓度至1M NaCl和优化pH至8.0，有效抑制了LCD的自组装倾向，使表达产物保持可溶性。

纯化工艺创新性体现在三步递进策略：首先利用镍柱结合His标签富集目标蛋白，随后通过TEV蛋白酶精准切割标签，最后采用超滤膜（0.22μm）和超滤柱（截留分子量10kDa）双重净化。关键质量控制指标包括A260/A280比值＜0.6（证明核酸污染＜5%），以及质谱检测显示完整蛋白的分子量误差小于4Da。特别设计的缓冲体系（50mM CAPS pH11.0）在维持高溶解度的同时，通过静电作用抑制蛋白与核酸结合，为后续相分离研究提供了理想载体。

动态光散射（DLS）和浊度测量联合分析揭示了LLPS的时空演化规律：在pH7.5缓冲体系（终浓度10μM）中，蛋白溶液在诱导相分离后30分钟内形成平均直径300nm的球形液滴，其浊度值（340nm）从初始的0.2NTU升至峰值2.8NTU。随着时间推移（60-90分钟），DLS显示平均粒径增长至1.5μm，且扩散系数（Dt）从0.84μm2/s降至0.3μm2/s，表明液滴逐渐固态化。显微成像进一步证实了这一过程：荧光探剂ThT标记显示，初始形成的球形液滴在30分钟后开始出现不规则边缘，2小时后完全转化为无定形聚集体。

结构生物学研究揭示了LCD的关键作用机制：AIUPred预测显示C末端（ residues 353-539）具有高度无序性（ disorder score 0.72），DynaMine计算表明该区域刚性系数（S2）低于0.4，证实其处于动态构象状态。值得注意的是，CIDER预测显示hnRNPA2B1在pH11.0时呈现电荷非均一性（κ=0.176），这种部分折叠状态有利于多价相互作用。质谱验证显示完整蛋白在缓冲体系中以二聚体（Mw≈79kDa）为主，这与超滤柱（截留分子量10kDa）洗脱峰位置吻合，说明在纯化过程中未发生不可逆聚合。

在相分离动力学研究中，作者创新性地采用pH跳跃策略：将预纯化的蛋白溶液（pH11.0）快速稀释至生理pH7.5，同时监测340nm和600nm吸光度变化。双波长检测发现，pH跳跃后5分钟内吸光度达到峰值（ΔA=0.35），随后呈现指数衰减，这一特性与液滴形成-合并-固化的三阶段模型高度吻合。离心实验显示98%的蛋白在液滴阶段聚集于管底，而超滤柱截留的核酸杂质（<0.5%）经紫外检测未见明显残留。

该研究突破性体现在三个方面：首先建立了首个不依赖标签或变性剂的全长hnRNPA2B1纯化体系，成功获得浓度达15μM（3mg/L）的稳定溶液；其次通过多维度表征（质谱、DLS、显微成像）完整描绘了LLPS的动态过程，发现其存在明确的相分离窗口期（60-90分钟）；最后提出的pH梯度保存方案（高pH稳定缓冲+快速pH跳跃诱导相分离）为同类蛋白研究提供了标准化操作流程。

在应用层面，该纯化方法可拓展至hnRNP家族其他成员（如hnRNPA1、hnRNPDL）及同类低复杂度蛋白的纯化研究。特别对于包含多个RRM结构域和LCD的蛋白，其多尺度相分离行为可能通过RRM与LCD的协同作用实现。此外，建立的蛋白保存技术（-80℃冷冻干燥，pH11.0储存缓冲液）有效避免了反复冻融导致的构象破坏，这一特性对研究相分离介导的病理蛋白聚集体（如als中的hnRNPA2B1纤维）至关重要。

该研究为解析LLPS驱动的疾病机制提供了新视角。例如，LCD的异常折叠可能通过形成自增强的纤维网络改变蛋白-核酸相互作用，这种结构变化在疾病模型中可通过mRNA剪接异常（实验显示剪接因子与LCD结合能力下降32%）和运输通路受阻（荧光恢复实验显示转运效率降低67%）得到验证。未来研究可结合冷冻电镜解析相分离不同阶段的动态构象，或通过微流控芯片模拟细胞微环境的相分离行为，从而建立从分子互作到组织病理的完整机制链条。

这项工作不仅解决了困扰结构生物学界多年的hnRNPA2B1纯化难题，更重要的是建立了非变性的相分离研究体系。该技术路线成功平衡了蛋白活性维持与实验条件控制，为研究RNA结合蛋白的相分离动力学提供了标准化解决方案。其核心创新点在于：①开发高盐低pH缓冲体系实现蛋白稳定表达；②建立多参数联用监测相分离动力学；③设计可逆相分离诱导方案。这些技术突破将显著提升LLPS相关疾病（如淀粉样蛋白错误折叠疾病）的基础研究效率，并为药物开发提供新的靶点（如抑制LCD自组装的分子伴侣筛选）。