基于squirrel工具的MPXV暴发检测与基因组分析：APOBEC3突变重建助力人畜共患病传播追踪

《Virus Evolution》：Human outbreak detection and best practice MPXV analysis and interpretation with squirrel

本研究针对MPXV（猴痘病毒）基因组分析中存在的技术挑战（如大基因组组装困难、APOBEC3突变识别复杂等），开发了开源生物信息学工具squirrel。该工具可实现分支感知比对、系统发育推断和APOBEC3突变自动分类，通过可视化报告帮助区分人畜共患传播和持续人际传播，为公共卫生决策提供关键技术支持。

　　

当猴痘病毒（MPXV）在2022年引发全球性暴发时，它已悄然在人群中传播了至少六年。这种拥有约20万个碱基对的大型双链DNA病毒，其基因组中的低复杂度区域和重复序列给测序分析带来巨大挑战。更关键的是，病毒在人际传播过程中会积累宿主APOBEC3酶介导的特异性突变，这成为区分人畜共患传播与持续人际传播的重要分子标志。然而，现有的分析工具难以有效处理MPXV特有的分析需求，包括分支特异性比对、APOBEC3突变重建等专业分析。

目前MPXV的多样性已划分为四个分支：Clade Ia、Ib、IIa和IIb，其中Clade IIb拥有最多的基因组数据。尽管MPXV早在1958年就被发现，但直到2017年Clade IIb暴发后，基因组测序数据才大幅增加。特别是在刚果民主共和国南基伍省新发现的Clade Ib，标志着又一起持续人际传播事件的出现。

为应对这些挑战，爱丁堡大学Aine O'Toole领衔的国际团队开发了squirrel（Some Quick Reconstruction to Resolve Evolutionary Links）工具。这一开源生物信息学工具整合了质量控制、系统发育分析和APOBEC3突变重建功能，能够自动处理MPXV基因组的特殊分析需求。

关键技术方法包括：基于随机森林模型的MPXV分支自动分配系统，使用minimap2进行分支特异性基因组比对，通过IQ-TREE 2进行最大似然系统发育分析，并实现APOBEC3驱动突变的自动识别与分类。研究使用的训练数据集包含来自Pathoplexus的8,116个MPXV基因组，涵盖所有已知分支。工具还提供交互式可视化报告，支持用户对可疑突变位点进行手动验证。

squirrel输出报告和QC功能确保数据推断的稳健性

squirrel生成的输出报告包含比对文件和树文件的链接，以及带有APOBEC3突变重建注释的系统发育树可视化结果。当在QC模式下运行时，报告会列出建议掩蔽的位点及其理由。用户可通过再次运行squirrel并添加掩蔽文件，生成更可靠的比对结果和系统发育树。研究显示，这一质量控制流程能有效识别和排除可能由组装或比对错误导致的突变，提高分析结果的可靠性。

随机森林模型分支分配对模糊性和多样性具有稳健性

研究人员比较了三种分支分配方法：基于pangoLEARN的随机森林模型、minimap2比对方法和Nextclade系统发育放置方法。测试结果显示，随机森林模型对序列模糊性（最高90%的N含量）和遗传多样性（最高45%的位点突变）都具有最强耐受性。即使在极端情况下，该模型仍能准确分配70.3%的序列分支，显著优于其他方法。

squirrel支持多种病毒分析和灵活的工作流程

除了MPXV，squirrel还能处理天花病毒（VARV）基因组分析。工具支持命令行和图形界面两种操作模式，用户可通过牛津纳米孔公司的EPI2ME平台使用squirrel-nf工作流程，无需命令行经验。工具还允许用户添加自定义背景数据集，方便将新生成数据与现有数据结合分析。

研究强调，squirrel是当前唯一能执行APOBEC3重建分析的工具，这一功能对于区分新发MPXV暴发的传播模式至关重要。通过准确识别APOBEC3编辑特征，研究人员可以判断病毒是否在人群中持续传播，以及传播时间长短，为公共卫生响应提供科学依据。

该研究的创新之处在于将多个分析步骤整合到统一框架中，解决了MPXV基因组分析的特殊挑战。工具的质量控制模块特别有助于识别和排除可能由技术因素导致的假阳性突变，提高系统发育分析的准确性。随着MPXV继续在人群中进化，squirrel的灵活性和易用性使其成为研究和公共卫生领域监控和控制MPXV的宝贵资源。

该论文发表在《Virus Evolution》期刊，所有代码和数据已在GitHub开源发布，遵循GNU-GPL v3.0许可证，支持全球科研人员进一步开发和应用于病原体基因组监测工作。