同源四倍体山药单倍型基因组解析薯蓣皂苷生物合成调控新机制

《Horticulture Research》：A haplotype-resolved chromosome-level genome assembly of autotetraploid Chinese yam (Dioscorea polystachya) elucidates dioscin biosynthesis and regulation

本研究针对山药(Dioscorea polystachya)缺乏高质量参考基因组的问题，构建了首个同源四倍体山药单倍型分型染色体级别基因组，揭示了薯蓣皂苷(dioscin)生物合成通路基因的加倍保留现象。研究人员发现DpbZIP12转录因子通过激活7-脱氢胆固醇还原酶(Dp7-DR)表达调控薯蓣皂苷积累，为山药品质改良提供了重要靶点和遗传资源。

　　

在中国悠久的农耕文明中，山药作为药食同源的重要作物，其栽培历史可追溯至数百年前。其中源自江西的"瑞昌山药"以其独特风味和丰富营养成分备受推崇，尤其富含具有重要药用价值的薯蓣皂苷(dioscin)。这种甾体皂苷不仅是合成皮质醇、孕烯醇酮等激素药物的工业前体，还具有抗炎、降血糖和抗肿瘤等多种生物活性。然而，由于山药雌雄异株的繁殖特性和缺乏高质量参考基因组，其薯蓣皂苷生物合成的分子调控机制一直是个未解之谜。

更复杂的是，山药属植物普遍存在种内多倍化现象，其中四倍体山药在产量和活性成分积累方面展现出显著优势。传统育种手段由于缺乏基因组信息的指导，难以精准调控薯蓣皂苷含量。因此，解析四倍体山药基因组结构并阐明薯蓣皂苷生物合成调控网络，对于山药分子育种和品质改良具有重大意义。发表在《Horticulture Research》的这项研究，正是针对这些关键问题展开的系统性探索。

研究人员采用PacBio HiFi长读长测序和Hi-C染色体构象捕获技术，结合k-mer分析和流式细胞术确定基因组特征，利用hifiasm软件进行单倍型分型组装，通过比较基因组学和转录组学分析基因保留和表达模式，运用病毒诱导基因沉默(VIGS)和瞬时过表达验证基因功能，采用酵母单杂交(Y1H)、双荧光素酶报告基因和凝胶迁移实验(EMSA)分析转录调控机制。

基因组组装与注释

通过41.20 Gb的HiFi长读长和76.47 Gb的短读长数据，研究团队成功构建了1.56 Gb的山药基因组，包含四个单倍型(Hap1-Hap4)，锚定到80条染色体上。BUSCO评估显示基因组完整性达96.4%，共注释到95,668个蛋白编码基因。重复序列占基因组的61.9%，表明山药基因组具有较高的复杂性。

单倍型分化与表达平衡

系统发育分析显示Hap1/Hap2和Hap3/Hap4分别形成两个主要谱系。尽管四倍体化后基因组发生分化，但Hap1和Hap3两个代表性"二倍体"伪基因组之间未表现出明显的亚基因组优势。基因表达分析发现，仅有2%左右的基因呈现单倍型特异性表达，绝大多数基因在两个单倍型间保持平衡表达。Ka/Ks分析进一步表明，双等位基因表达的基因具有更低的进化速率，说明其功能重要性。

全基因组加倍事件与进化分析

Ks分布分析揭示了山药经历了三次全基因组加倍(WGD)事件： monocotyledonous物种共享的tau事件(Ks=1.18)、Dioscoreaceae特异的delta事件(Ks=0.82)以及山药特有的四倍体化事件(Ks=0.020)。分子钟测定显示山药与近缘种D. alata的分化时间为4.64百万年前(Mya)，而特有的四倍体化事件发生在约1.42 Mya。

薯蓣皂苷生物合成通路基因的保留

比较基因组学分析显示，薯蓣皂苷生物合成通路基因在山药中的保留率(98.4%)显著高于背景基因保留率(91.3%)。特别是参与胆固醇合成的7-脱氢胆固醇还原酶(7-DR)基因，在四个单倍型中均高度保守且表达水平与薯蓣皂苷含量呈正相关。

Dp7-DR在薯蓣皂苷积累中的作用

时空表达谱分析发现Dp7-DR在块茎发育后期(T4阶段)特异性高表达，与薯蓣皂苷积累模式高度一致。亚细胞定位显示Dp7-DR主要定位于内质网。功能验证实验表明，沉默Dp7-DR导致胆固醇积累增加而薯蓣皂苷含量降低，而过表达则产生相反效应，证实了其在薯蓣皂苷生物合成中的关键作用。

DpbZIP12转录调控机制的解析

启动子分析发现Dp7-DR启动子区含有11个ABA响应元件(ABRE)。外源ABA处理能够显著诱导Dp7-DR表达和薯蓣皂苷积累。进一步筛选鉴定出bZIP A亚家族转录因子DpbZIP12，其表达与薯蓣皂苷含量密切相关。分子互作实验证实DpbZIP12能够直接结合Dp7-DR启动子并激活其转录。功能实验显示DpbZIP12通过调控Dp7-DR表达影响薯蓣皂苷合成。

研究结论表明，山药特有的全基因组加倍事件促进了薯蓣皂苷生物合成通路基因的保留和扩增，为高含量薯蓣皂苷积累提供了遗传基础。DpbZIP12-Dp7-DR调控模块的发现不仅阐明了ABA调控薯蓣皂苷生物合成的分子机制，也为山药分子育种提供了重要靶点。这项研究产生的单倍型分型基因组资源将极大推动山药功能基因组研究和遗传改良进程。

讨论部分指出，多倍化通过基因剂量效应和基因家族扩张显著增强了次级代谢产物的积累，这一现象在多种作物中均有体现。研究首次揭示了bZIP转录因子在薯蓣皂苷生物合成调控中的作用，拓展了植物甾体皂苷调控网络的认识。基于基因组信息的关键基因鉴定为山药品质改良提供了分子工具，未来通过基因编辑等技术调控DpbZIP12-Dp7-DR模块表达，有望实现薯蓣皂苷含量的精准调控，推动山药产业高质量发展。