1H-1,2,3-三唑衍生的吡喹酮类化合物具有TRPMPZQ调节活性，并对曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）的幼虫、若虫和成虫具有抗寄生虫作用

抗血吸虫药物哌嗪喹啉（PZQ）的1,2,3-三唑类衍生物合成及其抗血吸虫活性、TRPM离子通道选择性及分子机制研究。11个衍生物中6个（含合成中间体）对尾蚴有显著活性，其中化合物4对雄虫EC50=1.3-2.3 μM，5e对雌虫EC50=3.1-3.9 μM，选择性指数（SI）分别为155和75。分子建模显示PZQ结合位点Y1517侧链构象可变，允许9位位阻基团延伸，为结构优化提供新方向。

　　
本研究围绕抗血吸虫药物普拉喹酮（Praziquantel，PZQ）的衍生物开发展开，重点探索新型1,2,3-三唑类化合物对血吸虫不同发育阶段（尾蚴、幼体、成体）的杀灭活性及其作用机制。通过系统合成、体外活性筛选及分子动力学模拟，研究揭示了以下关键发现：

### 一、药物开发背景与核心问题
血吸虫病作为全球性热带病，累及240 million人口，其治疗高度依赖PZQ。尽管PZQ已应用40余年，仍面临多重挑战：对幼体虫杀灭效果不足（尤其是2-4周龄感染阶段）、成药剂型苦涩影响儿童依从性、存在潜在耐药风险（实验室已诱导出耐药株）。此外，PZQ对肝细胞毒性虽低（CC50＞300 μM），但药物代谢动力学特性（如半衰期长、水溶性差）限制了其优化空间。

### 二、化合物设计与合成策略
研究团队以PZQ为母核，通过硝化-还原-偶联反应构建1,4-二取代三唑体系。核心创新点在于：
1. **分子结构优化**：在PZQ的9位苯环引入1,2,3-三唑环，通过Huisgen偶联反应连接末端炔烃，形成刚性杂环结构。该设计既保留PZQ的疏水-亲水平衡特性，又增强分子极性以改善水溶性。
2. **合成路径创新**：采用微波辅助合成技术（反应时间10-15分钟）显著提高中间体（如4号化合物）的产率（最高达99%），同时通过COSY、HSQC等核磁共振技术实现结构确证。

### 三、体外活性评价体系
研究构建了多维度筛选体系：
1. **尾蚴活性初筛**：采用高内涵分析平台（Roboworm系统）检测50 μM浓度下化合物对尾蚴运动能力和形态的影响。6/11候选物通过双重指标（运动抑制＞35%且形态改变＞15%）确认为活性化合物，其中3号、4号、5e号被优先推进后续研究。
2. **幼体虫双重验证**：
- **代谢活性法（XTT）**：在100 μM浓度下，PZQ及衍生物3、4、5e显著降低幼体虫代谢活性（抑制率＞60%），而5c因分子量过大（4-芳基取代）未达统计学显著水平。
- **显微形态学分析**：通过分级评分（0-3分，3分为正常），发现5e号化合物在72小时处理下幼体虫健康状态评分（1.2分）显著低于对照组（2.8分），而5c号因过度抑制导致细胞质空泡化（图3数据需结合表S1）。

3. **成体虫运动抑制**：自动化图像分析显示，4号化合物对雄虫的半抑制浓度（EC50=1.3 μM）和5e号对雌虫（EC50=3.1 μM）均优于PZQ（雄虫EC50=0.28 μM），但5b、5c等含异丁基取代的衍生物因空间位阻导致活性下降＞10倍。

### 四、靶向机制解析
通过钙离子荧光报告基因技术（Fluo-4 AM）验证TRPM通道激活：
1. **野生型通道（Sm TRPM-PZQ）**：4号化合物（EC50=0.89 μM）激活效力与PZQ相当（EC50=0.50 μM），5e号次之（EC50=4.23 μM）。值得注意的是，所有活性化合物均未激活曼氏血吸虫的TRPM-MCLZ通道（负责幼体虫毒性机制），表明选择性靶向未被破坏。
2. **跨物种通道比较**：
- **肝吸虫TRPM-PZQ（Fh）**：因关键结合位点的Asn1388被Thr1270取代，所有化合物均无激活活性，解释了Fasciola属对PZQ的自然耐药性。
- **包虫TRPM-PZQ（Eg）**：5e号化合物表现出与PZQ相近的激活效力（EC50=1.49 μM），为开发多寄生虫共治药物提供新靶点。

### 五、选择性优化与结构-活性关系
1. **细胞毒性平衡**：通过HepG2细胞毒性筛选（48小时培养），发现5e号兼具高寄生虫活性（EC50=1.9 μM）与良好选择性（雄虫SI=155，雌虫SI=75），显著优于天然PZQ（SI＞1200）。而5b、5c因过度毒性（CC50=28 μM）导致SI＜1，提示需控制取代基体积。
2. **分子构象适应性**：分子模拟显示：
- **Y1517侧链柔韧性**：5e号诱导的苯酚氧基侧链构象变化（图6B），使取代基能适应S1-S4螺旋的构象偏移，而4号化合物刚性三唑环（图6A）则更依赖原始结合位点。
- **空间位阻阈值**：最佳取代基体积为n-丙基（5e号），异丁基（5b号）导致EC50上升至13 μM，而更小的甲基取代物则因结合力不足失效。

### 六、临床转化潜力评估
1. **剂型改进**：4号化合物（水溶性提升30%）和5e号（口服生物利用度预测提升15%）可能更适合开发缓释或速释制剂。
2. **耐药性防控**：通过引入三唑环（5e号代谢稳定性提升2倍）和优化取代基，可降低因单点突变（如L1515A）导致的耐药风险。
3. **多阶段治疗**：5e号对尾蚴（EC50=50 μM）、幼体（EC50=5.4 μM）和成体（EC50=1.7 μM）均保持活性，符合WHO推荐的一药多阶段治疗策略。

### 七、未来研究方向
1. **体内药效验证**：需通过尾蚴感染小鼠模型评估化合物对皮下单虫（Dermal Schistosomula）的穿透能力，当前体外数据显示5e号对幼体虫抑制率（72小时）达89%，但需补充药代动力学研究。
2. **耐药机制研究**：针对已诱导的K1突变株（如PZQ 30 μM下活性下降70%），需验证5e号是否通过调节Y1517构象避开突变位点的空间位阻。
3. **跨物种适用性**：基于Eg TRPM-PZQ的高效激活（EC50=0.21 μM），可探索其对其他吸虫（如肝吸虫、包虫）的交叉疗效。

### 八、技术突破与创新
1. **高通量筛选平台**：整合显微成像（分辨率5 μm）与自动分析系统（CellProfiler），将幼体虫形态学评估效率提升至200样本/小时。
2. **多通道选择性验证**：首次系统比较了Sm TRPM-PZQ、Fh TRPM-PZQ和Eg TRPM-PZQ的激活谱系，发现5e号对异源通道的激活效率（Eg：EC50=1.49 μM vs Sm：EC50=4.23 μM）为跨物种药物设计的理想基准。
3. **分子对接动态模拟**：采用AMBER力场模拟显示，三唑环的刚性结构（5e号）可稳定维持与N1388的氢键（ΔG=-4.2 kcal/mol），而柔性取代基（如4号）则通过侧链旋转（图6B）实现构象适应性调节。

### 九、公共卫生意义
研究提出的"三阶段递进式"药物筛选策略（尾蚴初筛→幼体复筛→成体终筛）可加速候选物开发周期。以5e号为例，其雄虫SI达155，接近PZQ水平（SI＞1200），且对雌虫保持75 SI，提示该化合物在性别差异显著的血吸虫病流行区（如非洲）可能具有更好的覆盖率。结合WHO的MDA推广需求，此类高选择性衍生物有望在2025年前进入临床试验阶段。