利用靶向蛋白质降解技术调控G蛋白偶联受体：CCR2分子降解剂的研发

本研究成功开发了首个靶向膜结合G蛋白偶联受体（GPCR）CCR2的分子降解剂，证实其通过溶酶体途径实现持续降解，并有效抑制单核细胞迁移。

　　
### 靶向蛋白降解（TPD）在膜结合G蛋白偶联受体（GPCR）中的应用研究：以CCR2为模型的发展与机制探索

#### 研究背景与意义
靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）作为药物研发领域的前沿技术，突破了传统靶向治疗的局限性。特别是针对膜结合蛋白如GPCR的研究，因其传统药物靶点的复杂性（如高动态周转率、低表达水平），长期面临降解效率不足的问题。本研究以CCR2为模型，成功开发了首个通过自噬-溶酶体途径降解的GPCR分子降解器（PROTACs），为开发新型抗炎和抗癌药物提供了重要工具。

#### 研究目标与方法
研究团队聚焦于以下科学问题：
1. **GPCR降解机制探索**：验证PROTACs能否通过细胞内结合有效招募泛素连接酶，并触发溶酶体依赖性降解。
2. **化合物筛选与优化**：基于已知的CCR2内源性配体和泛素连接酶靶向策略，设计并合成多组PROTACs，通过高通量筛选和功能验证确定最优候选分子。
3. **降解途径的分子机制**：通过抑制剂实验和实时成像技术，解析PROTACs的作用靶点及降解通路。

研究采用“药物设计-体外验证-机制解析”三阶段流程：
- **设计阶段**：以CCR2的已知的内源性配体（化合物1）为基础，结合CRBN、VHL等泛素连接酶的靶向配体，通过模块化连接设计PROTACs骨架。
- **筛选阶段**：利用膜结合蛋白的放射配体结合实验（[3H]CCR2-RA-[R]）和细胞功能抑制实验（xCELLigence阻抗法）双重筛选，剔除低效分子。
- **机制验证**：通过CRBN抑制剂（Pomalidomide）、溶酶体抑制剂（Baf-A1）及蛋白酶抑制剂（Bortezomib）的竞争实验，明确降解途径依赖性。

#### 关键发现与创新点
1. **首例GPCR溶酶体依赖性降解器**
研究发现，化合物LUF7996通过结合CCR2的细胞内界面，招募CRBN泛素连接酶，诱导受体蛋白的泛素化并靶向溶酶体降解。这一机制突破了传统PROTACs依赖蛋白酶体的限制，为GPCR治疗提供了新范式。

2. **PROTACs设计策略的优化**
- **配体亲和力平衡**：通过调整连接臂的长度和疏水性（如引入丙二醇胺基或聚乙二醇链），显著提升化合物对CCR2的亲和力（pIC50值达7 nM）与膜穿透性。
- **泛素连接酶选择**：优先选择CRBN（而非VHL或MDM2），因其对GPCR的泛素化效率更高，且在炎症相关疾病中表达稳定。

3. **转化医学价值**
LUF7996在THP-1单核细胞迁移实验中展现出与临床常用拮抗剂（如INCB3344）相当的抑制效果（84% vs 80%），且通过实时HiBiT检测证实其降解效率可持续24小时。这一特性使其在治疗转移性癌症和慢性炎症（如类风湿性关节炎）中具有潜力。

#### 技术突破与实验验证
1. **高通量筛选体系**
采用膜蛋白结合实验（[3H]CCR2-RA竞争法）与功能抑制实验（xCELLigence）联合评估，成功从50余种候选分子中筛选出4个高活性化合物（LUF7996、LUF8064等）。通过分子模拟发现，连接臂的疏水-亲水平衡可减少配体构象冲突，提升PROTACs稳定性。

2. **降解途径的机制解析**
- **CRBN依赖性**：合成CRBN功能缺失突变体（LUF8064突变体），其降解效率下降50%-70%，证实CRBN在PROTACs作用中不可或缺。
- **溶酶体特异性**：加入溶酶体抑制剂Baf-A1后，LUF7996的CCR2降解率从79%降至35%，而蛋白酶抑制剂Bortezomib未显著影响降解，表明其机制独立于蛋白酶体。
- **时间动态分析**：通过HiBiT实时监测发现，LUF7996在3小时内即可使CCR2水平下降50%，且降解效果在24小时后仍保持稳定，提示其长效作用机制。

3. **临床前转化潜力**
- **细胞毒性评估**：LUF7996在10 μM浓度下未对HEK293T细胞 viability（OD值>85%）及形态产生影响，安全性优于现有GPCR拮抗剂。
- **体内功能验证**：在THP-1细胞模型中，LUF7996通过抑制CCR2介导的CCL2信号通路，显著降低炎症因子表达（数据详见表2）。

#### 研究局限与未来方向
1. **当前局限**
- **靶向特异性**：需进一步验证PROTACs对其他GPCR（如CCR5）的交叉反应。
- **代谢稳定性**：化合物在体内的半衰期和代谢途径尚未明确。

2. **未来方向**
- **多靶点PROTACs开发**：结合CCR2与上下游信号分子（如NF-κB）的协同靶向策略。
- **临床前模型构建**：利用Pomabot等CRBN激动剂增强降解效率。
- **溶酶体机制深化**：解析CCR2在溶酶体中的具体定位及降解信号通路。

#### 结论
本研究建立了首个靶向GPCR的溶酶体依赖性降解器开发范式，其核心创新在于：
1. **设计策略**：基于内源性配体优化PROTACs结构，结合模块化连接臂设计提升膜穿透性。
2. **机制突破**：首次证实GPCR可通过溶酶体途径降解，为开发新型抗炎和抗癌药物提供理论依据。
3. **转化潜力**：LUF7996在单核细胞迁移抑制实验中表现优异，为后续临床前研究奠定基础。

该研究不仅拓展了PROTACs的应用范围（从胞内蛋白到膜结合受体），更为GPCR治疗提供了“双路径”策略：
- **短期调控**：通过拮抗剂阻断CCL2-CCR2信号轴。
- **长期根除**：通过PROTACs降解CCR2受体蛋白本身，解决传统拮抗剂无法触及的“药物口袋外”构象问题。

#### 数据总结与对比
| 指标 | LUF7996 | 临床拮抗剂（INCB3344） | 其他GPCR降解器（如GPER） |
|---------------------|---------|-------------------------|-------------------------|
| CCR2降解效率（10 μM） | 79% | 48% (体外功能抑制) | 30%-50%（蛋白酶体依赖） |
| 细胞穿透性 | ++ | + | + |
| 溶酶体依赖性 | 100% | N/A | 60%-80%（部分报道） |
| 24小时稳定性 | 85% | 10小时后降解率<40% | 依赖蛋白酶体活性 |

注：+/-表示降解效率（+为高效，-为低效）；数据来源于本研究及公开文献。

#### 伦理与转化意义
- **临床需求**：现有CCR2拮抗剂因无法降解受体蛋白，在长期治疗中易因受体代偿性上调失效。PROTACs可同步阻断信号通路并清除异常表达的受体。
- **机制创新**：首次揭示溶酶体依赖性降解在GPCR治疗中的应用，可能解决受体内吞-循环导致的药物抵抗问题。
- **技术延伸**：开发基于PROTACs的CRBN激活疗法，或可增强降解效率并扩大治疗范围。

#### 社会影响与展望
本研究为慢性炎症性疾病（如癌症转移、类风湿性关节炎）和自身免疫性疾病（如多发性骨髓瘤）的治疗提供了新思路。若后续临床前研究证实其安全性和有效性，可能推动首个PROTACs-GPCR疗法进入临床试验阶段，预计将缩短从靶点发现到药物上市的时间周期约30%-50%。