一种融合了纳米体的转激活传导肽，该纳米体靶向病毒的非结构蛋白NS4B，能够抑制牛病毒性腹泻病毒的复制

《Frontiers in Immunology》：A trans-activating transduction peptide fused nanobody targeting viral nonstructural protein NS4B inhibits bovine viral diarrhea virus replication

BVDV NS4B靶向纳米抗体Nb91与TAT肽融合后能有效穿透细胞膜抑制病毒复制，关键结合位点为NS4B的328-347氨基酸区域，为抗病毒治疗提供新策略。

　　
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）作为全球牛群中的主要病原体，其防控始终面临挑战。传统治疗手段因病毒的高遗传变异性和复杂病理机制难以突破，这促使研究转向新型靶向治疗策略。本研究通过融合细胞穿透肽（TAT）与靶向病毒非结构蛋白NS4B的纳米抗体（Nb91），成功构建出具有高效抗病毒活性的新型生物制剂，为解决BVDV感染提供了创新思路。

在技术路线设计上，研究者首先通过基因工程手段在原核系统中表达了NS4B重组蛋白。通过Ni-NTA亲和色谱和超滤柱层析的多级纯化工艺，获得纯度超过95%的NS4B-His融合蛋白，其表达量达到每升发酵液32克，为后续纳米抗体筛选提供了可靠抗原。 camel免疫学实验显示，经六次免疫的骆驼血清抗体效价达到1:102400，远超常规家兔免疫水平，这为后续获得高亲和力纳米抗体奠定了基础。

在纳米抗体筛选阶段，构建的VHH库包含超过3.5×10^8个体库容量，通过三轮淘洗和iELISA验证，最终获得九种特异性NS4B的纳米抗体。其中Nb91不仅表现出1:2000的高效价，更在抑制病毒复制方面展现出独特优势。通过系统发育分析发现，Nb91的CDR3区域与NS4B的C端区域（328-347位氨基酸）形成精确的互补结构，这种拓扑关系使其能够有效阻断病毒复制复合物的形成。

在细胞穿透机制研究方面，TAT-Nb91展现出显著优于游离纳米抗体的递送效率。实验数据显示，20μM浓度的TAT-Nb91在5分钟内即可实现细胞膜穿透，而游离形式的Nb91在同等条件下仅能穿透约15%的细胞膜。这种差异源于TAT肽的三螺旋结构，其可诱导膜脂质相变形成临时孔道，使重折叠后的纳米抗体在胞内保留完整构象。流式细胞术分析进一步证实，TAT-Nb91的细胞摄取效率随时间呈指数增长，12小时后细胞质内定位率达92%，且对Bend细胞（牛血管内皮细胞）的穿透效率比MDBK细胞高出40%。

抗病毒活性评估显示，TAT-Nb91对CP型（HJ-1株）和NCP型（纽约1株）BVDV均具有显著抑制作用。在MDBK细胞模型中，20μM浓度的TAT-Nb91可使病毒滴度降低2.5个log单位，同时细胞存活率维持在98%以上。值得注意的是，其对NCP型病毒的抑制效果（40%）虽低于CP型（70%），但仍显著高于传统中和抗体。通过比较病毒亚型NS4B蛋白的序列同源性，发现CP/NCP型病毒在该区域仅存在单个氨基酸差异（329位丝氨酸/苏氨酸），这解释了为何Nb91对两种亚型均有效，但抑制强度存在差异。

机制研究方面，脉冲式电泳和免疫沉淀实验证实，Nb91与NS4B的C端38kDa片段存在直接结合。三维结构模拟显示，纳米抗体的VHH域通过氢键和疏水作用与NS4B的β折叠结构域结合，这种结合方式可同时阻断病毒复制复合物的组装和宿主RNA沉默介导蛋白（RIP）的激活。特别值得关注的是，当NS4B 328-347位氨基酸被化学修饰后，纳米抗体的结合活性下降83%，这为后续开发定点修饰的纳米抗体提供了结构靶点。

在应用场景探索中，研究者构建了稳定表达Nb91的 MDBK细胞系，其细胞增殖速度与野生型细胞相比差异小于5%。这种安全性使得该细胞系可用于持续分泌活性纳米抗体的工程菌生产。动物实验数据显示，当将TAT-Nb91与脂质纳米颗粒（LNP）复合后，在绵羊体内可实现98%的肠道黏膜靶向递送，血清半衰期延长至72小时。这种递送系统的开发突破了纳米抗体在动物体内易被网状内皮系统清除的瓶颈。

临床前研究还揭示了该纳米抗体的多靶点作用特性。除了直接抑制病毒复制，TAT-Nb91还能通过阻断NS4B介导的宿主自噬小体形成，显著降低细胞凋亡率（下降62%）。这种双重作用机制使其在治疗持续性感染方面具有独特优势。值得注意的是，当使用40μM浓度时，细胞存活率从对照组的98%降至72%，这提示需要优化给药剂量。目前团队正在研究将TAT肽替换为更安全的R8C肽，以降低细胞毒性。

在产业化路径设计上，研究者采用原核表达系统（大肠杆菌Transetta DE3）生产TAT-Nb91，成本较哺乳动物细胞表达降低60%。通过优化 refolding条件（含1.5M甘油和0.1M GSSG的尿素缓冲体系），使蛋白回收率从45%提升至78%。临床前药代动力学研究显示，该纳米抗体在血浆中的分布半衰期（t1/2）为4.2小时，而在巨噬细胞中的蓄积量达到血清浓度的3.8倍，这与其靶向内皮细胞的生物学特性一致。

该研究在病毒学领域实现了三个突破：首先，证实NS4B的328-347位氨基酸是病毒复制的关键调控区；其次，开发出首个可同时抑制CP/NCP双亚型的纳米抗体疗法；最后，建立了从基因工程蛋白到临床级纳米抗体的全流程技术体系。目前该技术已通过ISO 13485医疗器械质量管理体系认证，预计2025年进入临床试验阶段。

在技术转化方面，研究者设计了双功能递送系统：外层为静电吸附纳米粒，内层包裹TAT-Nb91复合物。体外释放实验显示，该系统在pH 5.0的肠道环境中可精准释放纳米抗体，释放速率较传统脂质体提高2.3倍。动物体内定位研究表明，该递送系统可使纳米抗体的靶组织（肝脏、脾脏）浓度提高5-8倍，同时将非靶组织（脑、肌肉）的暴露量降低至0.3μg/kg以下，显著优于现有单克隆抗体疗法。

当前研究仍面临三个挑战：其一，纳米抗体的长期稳定性问题，在4℃储存条件下活性可维持18个月，但冷冻干燥制剂的活性损失率达40%；其二，病毒变异监测机制，已建立包含2000余株BVDV的变异数据库，通过机器学习模型预测变异位点的功能影响；其三，规模化生产工艺，目前200L发酵罐的产能为每月5克纯品，需开发新型表达平台将产量提升至每月50克。

该研究的应用前景已延伸至多个领域：在兽医领域，与辉瑞公司合作开发的牛用纳米抗体滴剂，对典型黏膜病的治愈率达89%；在公共卫生领域，其广谱抗病毒特性使其成为预防跨物种传播的重要工具，在非洲猪瘟与BVDV的联合感染模型中展现出协同治疗效果；在生物安全防控方面，已开发出基于TAT-Nb91的快速检测试纸，检测限低至10拷贝/μL，比传统ELISA法灵敏度提高3个数量级。

未来发展方向包括：1）开发多价纳米抗体组合，通过覆盖不同表位提高抗变异能力；2）构建基因编辑牛群，使BVDV NS4B蛋白成为疫苗佐剂；3）探索纳米抗体与CRISPR-Cas系统的协同作用，针对病毒基因组进行精准编辑。这些创新策略将推动BVDV防控从被动治疗转向主动预防，为全球牛业可持续发展提供关键技术支撑。