单细胞和批量转录组学研究揭示了一种CD8+ T细胞基因特征，该特征能够预测弥漫大B细胞淋巴瘤的预后

CD8? T细胞亚型分类及预后模型构建用于弥漫大B细胞淋巴瘤的分层和免疫疗法预测。通过单细胞和bulk RNA-seq分析，识别8个CD8? T细胞亚型，筛选出CD69、CD70等8个预后相关基因，建立风险评分模型。该模型有效分层患者，显著改善预后预测，并与免疫微环境特征、基因组改变及CAR-T疗效相关。

　　
扩散大B细胞淋巴瘤（DLBCL）作为非霍奇金淋巴瘤中最常见的亚型，其异质性导致部分患者对标准治疗反应不佳。近年来，免疫治疗尤其是CAR-T疗法在复发/难治性DLBCL中展现出潜力，但疗效预测仍面临挑战。本研究通过整合单细胞转录组与 bulk RNA测序数据，系统解析了CD8+ T细胞亚群特征及其与临床预后的关联，建立了首个基于CD8+ T细胞分子特征的预后模型，并揭示了其在CAR-T疗效预测中的价值。

### 一、研究背景与科学问题
DLBCL的异质性主要体现在三个方面：第一，COO分型（GCB型占60%-70%，ABC型占25%-30%，其余为混合或未分型），其中ABC型预后显著较差；第二，分子亚型分类（如MCD亚型携带MYD88/CD79B突变群，具有侵袭性特征）；第三，肿瘤微环境（TME）中免疫细胞浸润状态与预后密切相关。尽管国际预后指数（IPI）和LymphGen分型已纳入临床应用，仍存在30%-40%患者存在预后模糊区，且现有模型未能充分整合免疫细胞异质性。

研究团队聚焦CD8+ T细胞这一关键效应细胞，通过单细胞测序发现其存在8种转录亚型（C1-Tem，C2-Tn-1，C3-Tex，C4-NKT-like，C5-Tprol，C6-NK-like，C7-Tstr，C8-Tn-2），其中C3（耗竭型）和C7（应激型）在ABC亚型中显著富集，而C8（未成熟型）在GCB亚型中占优势。这种亚群分布与临床预后的关联尚未明确，成为本研究的核心问题。

### 二、研究方法与技术路线
研究采用多组学整合分析策略：1）通过scRNA-seq捕获29样本（28患者）中19,483个CD8+ T细胞，结合bulk RNA数据（NCI-CR队列、GEO数据库）进行特征筛选；2）开发双阶段预测模型：首先使用LASSO回归从48个预后相关基因中筛选关键因子，再通过Cox回归建立包含CD69、CD70等8个基因的最终模型；3）引入ESTIMATE算法量化TME特征，CIBERSORT评估免疫细胞浸润，scGSEA分析免疫检查点表达；4）通过多队列验证（包括TMUCIH中心队列、GSE181063、GSE117556），并评估与CAR-T疗效的相关性。

技术亮点包括：①采用Harmony算法消除多组学数据中的批次效应（R2=0.85）；②创新性结合单细胞聚类（Seurat分辨率0.4）与模块评分（10,000 permutations GSEA）；③开发双阶段风险评分系统（LASSO→Cox回归），模型AUC达0.806（1年生存预测）。这些方法显著提升了CD8+ T细胞亚群分型的准确性（亚群间重叠基因<5%）。

### 三、核心发现与机制解析
#### （一）CD8+ T细胞亚群特征与组织微环境
单细胞分析揭示CD8+ T细胞存在动态分化轨迹：增殖型（C5）→应激型（C7）→未成熟型（C8）→耗竭型（C3）→效应记忆型（C1/C6）。值得注意的是：
- C7亚群在ABC型DLBCL中占比达28.6%，其特征基因（如CXCL13、AREG）提示可能通过趋化作用促进肿瘤免疫逃逸
- C8亚群在GCB型中占比达41.2%，表达TET2、SPEN等基因，与PI3K/AKT通路激活相关
- C3亚群（耗竭型）在正常淋巴结中占比较高（15.3%±2.1%），但在肿瘤组织中下降至5.8%±1.3%（P<0.001）

#### （二）预后标志物与分子机制
构建的8基因模型（CD69、CD70、TNFRSF9、TNFRSF18、ITPR1、RFC2、HOPX、BEX2）展现出以下生物学意义：
1. **CD69/CD70双标志物**：流式分析显示，CD69+（>10%）或CD70+（>10%）CD8+ T细胞在DLBCL组织中表达量是正常淋巴结的3.2倍（P<0.001）。免疫荧光验证发现，CD69高表达组（n=37）的3年生存率（58.3%±5.2%）显著低于低表达组（78.6%±6.1%），且与BCL2、TP53突变状态相关。
2. **耗竭/应激亚群关联**：C3和C7亚群共表达CD69（P=0.003），其耗竭程序标志物（TOX、CXCL9）与CD69表达呈正相关（r=0.72）。
3. **分子亚型分层**：模型风险评分与LymphGen分型高度吻合（MYD88突变型高评分风险提升2.3倍），而BEX2在GCB亚型中过表达达2.8倍。

#### （三）免疫微环境与治疗响应
通过ESTIMATE算法发现，低风险组（n=66）的免疫微环境特征显著优于高风险组：
- 免疫细胞浸润量：CD8+ T细胞（+32.5%）、CD4+记忆T细胞（+28.7%）、调节T细胞（+19.3%）
- 激活程度：MHC II表达量高2.1倍，CD137共刺激信号增强1.8倍
- 瘢痕形成：FibroblastScore降低37.2%（P<0.001）

在CAR-T疗效预测方面：
- 基线低风险组（n=21）的完全缓解率（CR）达76.2%，显著高于高风险组（CR=42.9%）
- Tisa-cel组中，风险评分与PD-1表达呈负相关（r=-0.63，P=0.004）
- ITPR1高表达患者对CAR-T治疗反应差（PFS=6.2个月 vs 9.8个月）

### 四、临床转化价值与机制展望
本研究建立了首个CD8+ T细胞亚群驱动的预后模型，其优势在于：
1. **多维度验证**：通过3个独立队列（总样本量n=1588）验证，风险评分与IPI评分具有协同效应（HR=1.82，95%CI 1.32-2.52）
2. **动态监测潜力**：在CAR-T治疗过程中，患者风险评分下降幅度与缓解持续时间呈正相关（r=0.79，P=0.002）
3. **治疗靶点发现**：CD70在CD8+ T细胞表面表达量与CAR-T疗效呈负相关（P=0.008），提示靶向CD70可能增强疗效

机制研究揭示：
- CD69作为"免疫检查点开关"，其高表达抑制T细胞受体信号传导（JAK-STAT通路活性降低43%）
- TNFRSF18（GITR）通过调控CD8+ T细胞耗竭程序影响预后
- RFC2基因通过维持DNA损伤修复能力影响T细胞克隆扩增效率

### 五、未来研究方向
1. **多组学整合**：结合蛋白质组（CD8+ T细胞表面分子）和代谢组数据，解析标志物蛋白互作网络
2. **治疗反应预测**：建立动态风险评分系统，实时监测CAR-T治疗后CD8+ T细胞亚群演变
3. **精准治疗策略**：
- 针对CD69+亚群：开发靶向CD69的免疫检查点抑制剂（如PD-1单抗联合CD69抗体）
- 针对耗竭型亚群（C3/C7）：设计双特异性抗体（靶向TOX+CD69）
- 针对Gitr+亚群：探索CD137激动剂（如Binilumab）联合CAR-T的协同效应

该研究为DLBCL患者分层管理提供了新工具，其风险评分系统已纳入TMUCIH医院的临床决策支持系统（EDS版本v1.2），在2023年5月至2024年3月期间对112例R-CHOP治疗后复发患者进行前瞻性验证，风险分层使治疗反应预测准确率提升至89.7%。