APOBEC3B通过p53负调控驱动突变促进前列腺癌进展与免疫抑制微环境形成

《Molecular and Cellular Biochemistry》：APOBEC3B-driven mutations negatively regulated by P53 promote tumor progression and immunosuppressive microenvironment in prostate cancer

本研究针对前列腺癌(PCa)中APOBEC3B(A3B)的促癌机制不明确的问题，通过多组学分析和实验验证发现A3B在PCa中显著高表达且与不良预后相关。研究人员证实A3B通过诱导C>T突变促进肿瘤恶性进展，并首次揭示p53负调控A3B表达的新机制。更重要的是，发现A3B高表达与免疫抑制细胞（Tregs、CD8+PD-1+T细胞等）浸润及免疫检查点基因(ICGs)上调密切相关，为PCa免疫治疗提供了新靶点。

　　

在全球男性健康领域，前列腺癌(PCa)始终是挥之不去的阴影，其发病率近年来持续攀升。尤其令人担忧的是，早期PCa症状隐匿，许多患者确诊时已处于局部浸润或远处转移的晚期阶段，错失手术根治的最佳时机。虽然雄激素剥夺治疗(ADT)是晚期PCa的主要手段，但绝大多数患者最终会进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，预后极差。面对这一困境，肿瘤免疫治疗，特别是免疫检查点阻断(ICB)疗法，展现出广阔前景。然而，PCa的免疫相关分子机制仍不清晰，寻找能够精准预测免疫治疗疗效、并反映肿瘤免疫微环境特征的生物标志物，成为当前研究的迫切需求。

在肿瘤发生发展的复杂过程中，体细胞突变的累积是核心驱动力。除了外界致癌因素，内源性突变源也日益受到关注。APOBEC家族细胞脱氨酶便是其中一员，它们能催化单链DNA中的胞嘧啶(C)脱氨变为尿嘧啶(U)，导致DNA复制或修复过程中产生C>T突变。APOBEC3B(A3B)作为该家族的重要成员，在多种癌症中异常高表达，且与高肿瘤突变负荷(TMB)和不良预后密切相关。然而，A3B在PCa中的具体功能，特别是其如何通过驱动突变影响肿瘤进化并调控肿瘤免疫微环境，仍有待深入揭示。

为此，发表在《Molecular and Cellular Biochemistry》上的这项研究，旨在通过利用公共数据库、临床组织样本、体外细胞模型和体内动物模型进行多层次综合分析，验证A3B在PCa中的表达及其对肿瘤细胞恶性生物学行为和肿瘤免疫微环境的影响。

本研究采用的关键技术方法包括：基于TCGA数据库的生物信息学分析（包括差异表达基因、GO/KEGG/GSEA富集分析、肿瘤微环境评估、肿瘤突变负荷分析）；免疫组织化学(IHC)和多重免疫荧光(mfIHC)染色技术（使用包含100例癌组织和50例癌旁组织的组织微阵列）；定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western blotting)检测基因和蛋白表达；细胞功能实验（CCK-8、EdU、集落形成、Transwell迁移/侵袭实验）；体外脱氨酶活性检测（无嘌呤/无嘧啶位点(AP site)测定）；基因操作（构建稳定敲低A3B的PC-3细胞系和稳定过表达A3B的22RV1细胞系，并使用p53激动剂Nutlin-3和p53 siRNA进行干预）；以及体内动物实验（皮下移植瘤模型）。

Bioinformatics analysis of A3B expression in PCa tissues is associated with clinicopathological features and somatic mutations

对TCGA数据的分析显示，A3B在PCa组织中的表达显著高于正常前列腺组织，且与更高的Gleason评分、更晚的T分期/N分期以及更差的总体生存率(OS)相关。突变谱分析表明，A3B高表达组具有显著更多的C>T突变（数量：8875 vs. 2758；比例：61.7% vs. 48.3%），这提示A3B的胞嘧啶脱氨酶活性在PCa的突变过程中扮演了重要角色。进一步分析发现，这种A3B特征性C>T突变富集在晚期（T3期）和高Gleason评分（G9-10）的肿瘤中。

Elevated A3B expression in PCa tissues and cell lines

通过免疫组织化学(IHC)染色证实，A3B蛋白在PCa组织中的表达水平显著高于癌旁组织，并且在高Gleason评分(>8)的肿瘤中表达更高。在细胞水平，qRT-PCR和蛋白质印迹结果均显示，与正常前列腺上皮细胞RWPE-1相比，A3B在多个PCa细胞系（LNCaP, 22RV1, DU145, PC-3）中表达上调，其中PC-3细胞表达最高，22RV1细胞表达相对较低。

A3B promotes proliferation, migration and invasion of PCa cells in vitro

功能富集分析表明，A3B参与细胞周期调控、DNA修复、上皮间质转化(EMT)等生物学过程。为了验证A3B的功能，研究者在PC-3细胞（高表达A3B）中敲低A3B，并在22RV1细胞（低表达A3B）中过表达A3B。体外功能实验表明，敲低A3B能显著抑制PC-3细胞的增殖（CCK-8、EdU、集落形成实验）、迁移和侵袭能力（Transwell实验），并逆转EMT进程（上调E-Cadherin，下调N-Cadherin、Vimentin、Snail及MMP2/9）。相反，过表达A3B则增强了22RV1细胞的这些恶性表型。AP位点检测证实A3B的表达水平与其脱氨酶活性正相关。

Downregulation of A3B inhibits PC-3 cell tumor growth in vivo

体内动物实验进一步支持了体外结果。将稳定敲低A3B的PC-3细胞皮下接种到裸鼠体内后，肿瘤的生长速度显著慢于对照组。取出肿瘤后进行的IHC染色显示，敲低A3B的肿瘤组织中增殖标志物Ki67和侵袭相关蛋白MMP2/9的表达也显著降低。

P53 inhibits A3B expression in PCa cells

机制探讨发现，p53是A3B表达的关键负调控因子。TCGA数据分析显示，p53突变组中A3B表达更高。在表达野生型p53的22RV1细胞中，p53激动剂Nutlin-3能抑制A3B的表达并减少AP位点数量，同时激活p53下游基因p21和BAX。而在p53缺失的PC-3细胞中，Nutlin-3无此效应。反之，在22RV1细胞中用siRNA敲低p53，则会上调A3B表达并增加AP位点。将野生型p53质粒转染进PC-3细胞，则可抑制A3B表达和AP位点形成。这些结果明确了p53对A3B表达的抑制作用。

High A3B expression in PCa tissues is associated with immunosuppressive cell infiltration and ICGs expression

研究进一步深入探讨了A3B与肿瘤免疫微环境的关系。生物信息学分析显示，A3B高表达与免疫抑制细胞（如调节性T细胞(Tregs)、2型辅助T细胞(Th2)、髓源性抑制细胞(MDSCs)）的浸润增加，以及免疫抑制性趋化因子（如CCR4, CCR5, CCR1, CXCL16）和免疫检查点基因(ICGs)（如PDCD1(PD-1), CTLA-4, HAVCR2(TIM-3), TIGIT, IL10）的表达上调正相关。多重免疫荧光(mfIHC)分析证实，在A3B高表达的PCa组织中，CD4⁺FoxP3⁺Tregs、CD8⁺PD-1⁺T细胞和CD163⁺巨噬细胞的浸润数量显著更多。在PC-3细胞中敲低A3B后，多种免疫抑制相关分子（如IL10, CXCL16, PDL2, TGFBR1, IDO1）的mRNA表达水平下降。

结论与讨论

本研究系统性地揭示了A3B在PCa中的致癌作用及其分子免疫机制。主要结论包括：首先，A3B在PCa组织和细胞中显著高表达，且与高级别Gleason评分、晚期临床分期和不良预后密切相关。其次，A3B通过其脱氨酶活性诱导基因组C>T突变，进而促进PCa细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT进程。第三，p53作为重要的肿瘤抑制因子，能够负向调控A3B的表达，从而减轻A3B引起的基因组不稳定性。最后，也是本研究的重要创新点，即发现A3B高表达与PCa免疫抑制微环境的形成密切相关，表现为免疫抑制性细胞浸润增加和免疫检查点分子表达上调。

这项研究的深刻意义在于，它不仅阐明了A3B作为癌基因在PCa进展中的直接作用，还揭示了其通过塑造免疫抑制微环境间接促进免疫逃逸的新功能。这为理解PCa，特别是晚期和去势抵抗性PCa的发病机制提供了新的视角。A3B有望成为一个有潜力的新型预后生物标志物。更重要的是，针对A3B的干预策略，例如开发A3B抑制剂，可能具有双重益处：一方面直接抑制肿瘤细胞的进化和恶性行为，另一方面逆转肿瘤免疫抑制状态，从而增强现有免疫疗法（如ICB）的疗效。这为开发PCa的个体化治疗策略，尤其是联合免疫治疗的新方案，奠定了重要的理论基础和实验依据。