Vav1调控hiPSCs向β细胞分化中胰岛素/PDX1/miR-375表达轴：改善体外生成胰岛素生成细胞的新靶点

《Tissue Engineering and Regenerative Medicine》：Vav1 Sustains the Expression of Insulin, PDX1 and miR-375 During Differentiation of hiPSCs to β Cells: A Potential Target to Improve the In Vitro Generation of Insulin-Producing Cells

本研究针对1型糖尿病(T1D)细胞替代疗法中人多能干细胞(hiPSCs)分化为功能性β细胞效率不足的难题，探讨了造血信号蛋白Vav1在β细胞生成过程中的作用。研究人员通过七步分化法将hiPSCs诱导为胰岛素生成细胞(IPCs)，发现Vav1表达呈现动态变化且其适量表达是胰腺前体细胞生成IPCs的关键。研究证实Vav1通过维持转录因子PDX1及其靶点miR-375的表达，并负调控Akt激酶活性，构成Vav1/PDX1/miR-375/Akt信号轴。该发现为优化hiPSCs体外定向分化为IPCs提供了新靶点，对推进T1D细胞治疗具有重要意义。

　　

在全球范围内，1型糖尿病（Type 1 Diabetes, T1D）患者数量正持续增长，这种自身免疫性疾病导致胰腺中产生胰岛素的β细胞被破坏，患者需要终身依赖外源性胰岛素治疗。然而，胰岛素注射难以实现生理性的血糖精确调控，频繁的高血糖和低血糖事件严重影响患者的生活质量并可能导致严重并发症。胰腺胰岛移植虽能恢复内源性胰岛素分泌，却面临供体短缺和长期免疫抑制的挑战。因此，利用人多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）在体外定向分化为胰岛素生成细胞（insulin-producing cells, IPCs），为T1D的细胞替代疗法带来了希望。尽管现有的分化方案能模拟体内胰腺发育过程获得β样细胞，但分化效率不均一、细胞功能不完善以及移植后可能存在未分化细胞等问题，制约了其临床应用。究其根源，人们对调控β细胞成熟的关键细胞内机制仍知之甚少。

在此背景下，由Marina Pierantoni、Valentina Zamarian等研究人员组成的研究团队，将目光投向了一个在造血系统和非实体瘤中研究较多，但在β细胞生成中角色未知的蛋白——Vav1。这篇发表在《Tissue Engineering and Regenerative Medicine》上的研究，旨在揭示Vav1在hiPSCs向β细胞分化过程中的作用及其分子机制，以期找到提升IPCs生成效率的新策略。

研究人员采用了一项成熟的七步分化方案，历时25天将hiPSCs逐步诱导为IPCs。该过程的关键技术方法包括：通过流式细胞术监测各分化阶段特异性标志物（如OCT4, CXCR4, NKX6.1, PDX1, INS, GCG）以确认分化轨迹；利用葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验评估终末iβ细胞的功能成熟度；通过脂质体转染技术在胰腺前体细胞（PP阶段）和内分泌前体细胞（EP阶段）分别进行Vav1的基因沉默（siRNA）和过表达（pEF Vav1质粒）；并综合运用蛋白质印迹（Western blot）、实时定量PCR（RT-qPCR）、免疫细胞化学及共聚焦显微镜等技术，系统分析Vav1及其下游关键分子（PDX1, miR-375, Akt）的表达与定位变化。

3.1 Vav1在hiPSCs向iβ细胞分化过程中的表达

研究首先确认了分化体系的可靠性，hiPSCs成功分化为具有胰岛样结构的细胞团，其中约30%的细胞为胰岛素阳性且胰高血糖素阴性，并且这些iβ细胞能够响应葡萄糖刺激分泌胰岛素（图1C）。随后，研究人员检测了Vav1在分化过程中的动态变化。RT-qPCR和蛋白质印迹分析均显示，Vav1的表达并非一成不变：其在多能干细胞中水平较高，随分化进行至胰腺前体细胞（PP）阶段时降至最低；然而，在细胞向内分泌谱系定向（EP阶段）时，Vav1蛋白表达出现一个明显的峰值；进入最终的iβ阶段后，其水平再次下降（图2A, B）。免疫荧光和共聚焦显微镜分析进一步揭示，Vav1存在于细胞的胞浆和核内，EP阶段Vav1总量的增加主要源于胞浆部分的显著升高，而核内Vav1在PP阶段相对较高，在EP和iβ阶段则维持在较低且相似的水平（图3A-C）。与此同时，胰岛素阳性细胞的比例从PP到iβ阶段逐渐增加，但其表达强度与Vav1水平并无简单的线性关系，提示细胞群体存在异质性，且Vav1的作用可能具有阶段特异性。

3.2 Vav1调制对胰岛素水平的影响

为了探究Vav1峰值和后续下降的功能意义，研究团队在分化关键节点进行了干预。在Vav1峰值出现前（PP阶段）进行基因沉默，有效阻断了其在EP阶段的升高（图4A, B）。与此相应，这些细胞中胰岛素的荧光信号强度也显著降低（图4C）。相反，在Vav1峰值过后（EP阶段）强制其过表达，虽然由于表达水平过高难以在同一细胞中同时评估Vav1和胰岛素，但单独检测显示胰岛素信号出现了轻微但具有统计学意义的增强（图4D）。这些结果说明，适时的Vav1表达对于胰腺前体细胞成功分化为产胰岛素的β细胞至关重要，抑制其生理性升高会损害胰岛素生成，而维持其高水平则可能对分化有轻微促进作用。

3.3 Vav1调制对PDX1和miR-375水平的影响

PDX1是调控胰岛素基因表达的关键转录因子。本研究发现在hiPSCs分化过程中，PDX1的表达后期也会下降（图1B）。鉴于Vav1在胰腺癌细胞转分化中能支持PDX1表达，研究人员检验了Vav1是否在hiPSCs分化中扮演类似角色。果然，在EP阶段沉默Vav1导致PDX1蛋白水平显著降低，而过表达Vav1则使其显著升高（图5A, B）。此外，microRNA miR-375是PDX1的靶基因，对β细胞质量和功能至关重要。研究发现miR-375在分化过程中也呈动态变化（图5C）。在EP阶段，Vav1的沉默引起miR-375水平大幅下降，而过表达则使其轻微但显著上升（图5D）。这表明Vav1通过调控PDX1，进而影响miR-375的表达，共同参与调节胰岛素的生产。

3.4 Vav1强制调制对Akt丝氨酸/苏氨酸激酶的影响

Akt激酶在β细胞存活、增殖和胰岛素分泌中作用重要，且已知在某些癌细胞中受Vav1调控。本研究分析了Akt1和Akt2两种亚型。结果显示，Akt1的Ser⁴⁷³位点磷酸化（激活标志）从PP到iβ阶段逐渐增加，而Akt2的表达及其Ser⁴⁷⁴位点磷酸化主要在iβ阶段显著上调（图6A, B）。机制上，Vav1的沉默导致磷酸化Akt1水平和Akt2总蛋白水平均显著增加，而过表达Vav1对p-Akt1影响不显著（图6C, D）。这表明Vav1的减少与Akt信号通路的激活存在关联，而miR-375已知可抑制Akt激活，提示Vav1可能通过miR-375间接调控Akt。

4 讨论

本研究系统阐述了Vav1在hiPSCs向IPCs分化过程中的重要作用。研究结果表明，Vav1的表达具有阶段特异性，其在内分泌前体细胞阶段的峰值对于后续成功生成IPCs至关重要。研究揭示了Vav1、PDX1、miR-375和Akt之间构成一条新的信号轴（图7）：Vav1支持PDX1的表达，PDX1调控miR-375，而miR-375又可抑制Akt的激活。Akt的异常激活可能影响β细胞的正常功能，而Vav1通过维持此轴的平衡，参与 orchestrate 功能性β细胞的生成。这一发现不仅深化了对β细胞分化机制的理解，更重要的是，指出了Vav1是一个潜在的、可用于优化体外IPCs生成效率的分子靶点。通过在该分化过程的特定阶段精确调制Vav1的水平，或许能促进内分泌前体细胞更同步、更有效地成熟，提高胰岛素表达，减少未分化细胞的残留，从而为T1D的细胞替代疗法提供质量更高、更安全的细胞来源。未来的研究可进一步阐明Vav1核内与胞浆功能的具体差异，并探索其在其他干细胞模型或体内移植后的长期效果，推动该发现向临床应用的转化。