多能性因子OCT4通过性别特异性调控血管生成的新机制

《Angiogenesis》：Sex-specific angiogenic responses in endothelial cells—role of the pluripotency factor OCT4

本研究揭示了多能性因子OCT4在血管内皮细胞中具有性别特异性功能，通过皮肤创伤、黑色素瘤肿瘤植入和下肢缺血模型，发现OCT4缺失在雄性小鼠中促进血管生成和修复，而在雌性小鼠中则延迟伤口愈合并加速肿瘤生长。机制上，OCT4通过差异性调控MCP1等关键因子介导性别差异，为心血管疾病和癌症的性别特异性治疗策略提供了新见解。

　　

在生命科学领域，血管内皮细胞不仅仅是血液与组织之间的简单屏障，更是调控血管通透性、血管张力和血液凝固的关键角色。当血管受到炎症或异常血流冲击时，内皮细胞会被激活，导致一系列病理变化，例如动脉粥样硬化。这种激活表现为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的下调、细胞表面粘附分子(如ICAM和VCAM)的上调以及促炎细胞因子的释放，最终引发慢性炎症和临床后遗症。血管生成，即从已有血管系统中形成新血管的过程，在胚胎发育、生理性组织重塑和成人损伤修复中至关重要。然而，病理性血管生成，如动脉粥样硬化和癌症中的异常血管形成，会通过促进慢性炎症加剧疾病进展。

尽管血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂已被用于临床治疗心血管疾病和癌症，但其疗效有限，部分原因是VEGF抑制会引发肿瘤坏死因子α(TNFα)/核因子κB(NF-κB)依赖的促炎效应，增加免疫细胞浸润和血管毒性，导致血栓事件。因此，深入理解病理性血管生成的具体分子机制，对于开发新的治疗策略至关重要。

多能性转录因子OCT4(由POU5F1基因编码)在胚胎干细胞分化和诱导多能干细胞(iPSCs)生成中扮演关键角色。传统观点认为OCT4在成人细胞中永久沉默，但近年研究发现，在平滑肌细胞(SMCs)和内皮细胞等血管细胞中，OCT4可在病理条件下被重新激活。先前研究表明，OCT4通过调节炎症和代谢功能在内皮细胞中发挥抗动脉粥样硬化作用。内皮细胞特异性OCT4缺失会加剧主动脉脂质负担，部分原因是内皮细胞激活和巨噬细胞积累增加。此外，OCT4缺失还会导致斑块内出血和新生血管形成增加，提示OCT4是内皮驱动血管生成的调控因子。

然而，Apoe^-/-小鼠模型因高胆固醇和系统性炎症水平、长期斑块发展以及斑块定位在大动脉而非更相关于血管生成研究的微血管，限制了其对急性血管生成反应的研究。因此，本研究旨在利用非动脉粥样硬化模型，阐明内皮OCT4在血管生成中的作用。同时，临床研究报道抗血管生成疗法存在性别特异性差异，包括不良反应和治疗效果的不同，凸显了理解性别差异机制以优化治疗结果的必要性。

本研究利用他莫昔芬诱导的内皮细胞特异性OCT4基因敲除小鼠(Pou5f1^Flox/FloxCdh5-CreERT2⁺，简称Oct4^Δ/Δ)及其同窝野生型对照(Oct4^+/+)，通过皮肤创伤愈合、黑色素瘤肿瘤植入和下肢缺血(HLI)等模型，探究了OCT4在雄性和雌性小鼠血管生成中的作用。研究发现，在野生型小鼠中存在显著的性别二态性，且OCT4缺失在所有体内模型中均引起性别差异反应。雄性OCT4敲除小鼠表现出更快的皮肤伤口愈合、增加的新生血管形成以及下肢缺血后更快的血流恢复；而雌性OCT4敲除小鼠则伤口愈合延迟、下肢缺血后血流恢复无显著变化，且肿瘤生长加速。机制上，单核细胞趋化蛋白1(MCP1)在雄性和雌性OCT4敲除小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)中受到差异性调控，表明OCT4依赖的MCP1调控是血管生成反应性别差异的关键机制。RNA测序(RNAseq)分析进一步揭示了OCT4缺失后雄性和雌性MAECs中不同的基因表达谱，雌性内皮细胞中促炎基因上调，而雄性内皮细胞中细胞周期和血管生成相关基因表达增加。

研究主要应用了以下几种关键技术方法：利用内皮细胞特异性诱导性基因敲除小鼠模型进行在体功能研究；通过皮肤创伤模型、下肢缺血手术和黑色素瘤肿瘤模型评估血管生成和炎症反应；采用原代小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)分离培养进行体外细胞功能验证（包括细胞增殖BrdU assay、体外划痕愈合assay、基质胶Tube formation assay、单核细胞粘附assay等）；运用蛋白质组抗体芯片分析血管生成相关蛋白表达；通过Western blot验证特定蛋白水平；进行批量RNA测序(RNAseq)及生物信息学分析（差异表达基因分析、通路富集分析如MSigDB Hallmark和KEGG分析）以揭示分子机制。

Loss of endothelial OCT4 enhances angiogenic responses in vivo in a sex-dependent manner

研究人员首先在三种不同的血管生成依赖模型中观察了内皮OCT4缺失的体内效应。在皮肤创伤愈合模型中，野生型雌性小鼠比雄性愈合更快，但具有更多的髓系细胞浸润和较少的新生血管形成。OCT4缺失在雄性小鼠中加速了伤口愈合，增加了髓系细胞浸润和血管化；而在雌性小鼠中则延迟了伤口愈合，对髓系细胞浸润无显著影响，但仍增加了血管化。在下肢缺血(HLI)模型中，野生型雌性小鼠的血流恢复和缺血肌肉毛细血管形成均差于雄性。OCT4缺失显著改善了雄性小鼠的血流恢复和毛细血管形成，但对雌性小鼠无显著影响。在黑色素瘤肿瘤模型中，野生型雌性小鼠的肿瘤体积更小，肿瘤周围皮肤血管化更少。OCT4缺失显著增强了雌性小鼠的肿瘤血管化和肿瘤生长，而在雄性小鼠中无显著差异。这些结果综合表明，在不同炎症水平的血管生成模型中，存在显著的基线性别差异，并且OCT4缺失对血管生成反应产生性别依赖性的相反影响。

Loss of OCT4 results in increased angiogenic potential in cultured ECs

为了在细胞水平上探讨机制，研究人员从雄性和雌性OCT4野生型和敲除小鼠中分离了原代小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)。体外实验表明，野生型雄性MAECs在标准培养条件下比雌性MAECs具有更高的细胞活力、增殖能力、体外划痕愈合能力和基质胶管形成能力。OCT4缺失显著增强了雄性和雌性MAECs的这些血管生成参数，但雌性OCT4敲除细胞的血管生成潜力仍低于雄性敲除细胞。在单核细胞粘附实验中，OCT4缺失显著促进了雄性MAECs的单核细胞粘附，而对雌性细胞无影响。血管生成蛋白组 profiling 显示，OCT4缺失导致雄性MAECs中MCP1、IGFBP3和VEGFB显著上调，而雌性细胞中NOV(CCN3)和FGF1上调，揭示了OCT4缺失后性别特异性的血管生成相关蛋白表达变化。

MCP1 is essential for OCT4-dependent angiogenic responses in male but not in female ECs

基于蛋白质组学结果和MCP1在血管生成中的已知作用，研究人员重点研究了MCP1。Western blot证实MCP1蛋白水平在雄性OCT4敲除MAECs中显著上调，而在雌性细胞中无变化。通过使用MCP1合成抑制剂Bindarit和MCP1中和抗体进行挽救实验，发现抑制MCP1能够显著降低雄性OCT4敲除MAECs的细胞增殖和体外划痕愈合能力，以及基质胶管形成能力。然而，MCP1抑制对雌性OCT4敲除细胞的血管生成功能没有影响。这些结果表明，MCP1是介导雄性内皮细胞中OCT4依赖性血管生成反应的关键因子，而这种作用在雌性细胞中不存在。

RNA-sequencing analysis revealed the characteristics of Oct4^+/+and Oct4^Δ/Δmale and female ECs

批量RNA测序分析进一步揭示了OCT4缺失引起的性别特异性转录组变化。差异表达分析发现，与雄性OCT4敲除MAECs相比，雌性敲除细胞中有2317个基因上调，1504个基因下调。通路富集分析显示，雌性细胞中上调的基因富集于干扰素-α(IFNα)、干扰素-γ(IFNγ)、炎症反应和TNFα信号通路等相关通路；而雄性细胞中则富集于细胞周期、血管生成和上皮-间质转化（EndoMT）相关通路。热图分析证实，雌性野生型和OCT4敲除MAECs中IFNα和IFNγ相关基因的表达水平均高于雄性对应细胞，且OCT4缺失在雌性细胞中导致这些IFN基因进一步上调。雄性OCT4敲除细胞中细胞周期相关基因表达升高，而雌性细胞中影响甚微。此外，RNAseq分析揭示了X染色体基因在OCT4敲除后存在显著的性别差异性表达，雄性敲除细胞中上调的X染色体基因较少，而雌性细胞中大量X染色体基因上调，其中包括66个已知不同程度逃避X染色体失活(XCI)的基因，如Nexmif、Tlr7、Cybb、Llcam和Ikbkg(NEMO)等。对MCP1受体（CCR1, CCR2, CCR3, CCR5）的分析发现，OCT4敲除导致CCR2和CCR3在雄性和雌性细胞中均无法检测到，而CCR1显著增加（雌性增加更甚），CCR5轻微增加（雄性更高），提示MCP1依赖性表型可能部分源于受体表达失调。

本研究首次揭示了多能性因子OCT4在体细胞（内皮细胞）中具有性别特异性功能。OCT4缺失通过差异性调控MCP1等关键因子，在雄性中促进血管生成和组织修复，而在雌性中则可能因基线促炎状态较高（如IFN信号通路激活）而表现出不同的反应模式，甚至在某些情况下（如肿瘤）加剧病理进程。RNAseq结果提示OCT4可能通过影响X染色体失活相关基因（如Tlr7）的表达，参与调控内皮细胞的性别二态性。这些发现强调了在心血管疾病和癌症的临床前研究和治疗开发中考虑性别因素的重要性，为开发性别特异性的内皮细胞靶向治疗策略提供了新的理论依据和潜在靶点。尽管存在一些局限性，如难以量化体细胞中低水平OCT4的性别差异，以及主动脉内皮细胞与微血管内皮细胞的潜在功能差异，但本研究为理解OCT4在血管生物学中的复杂作用开辟了新的方向。未来的研究需要进一步阐明OCT4调控性别差异的分子机制，特别是性激素和性染色体互补的影响，以推动精准医疗的发展。