两亲霉素B纳米纤维贴片靶向治疗硕大利什曼原虫所致皮肤利什曼病的临床前研究

《Parasitology Research》：Nanofibrous patches for targeted therapy of cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania major: a preclinical amphotericin B platform

本研究针对皮肤利什曼病(CL)治疗中两亲霉素B(AmB)系统毒性大和给药不便的难题，开发了壳聚糖/明胶/PVA载药纳米纤维贴片。通过双喷头静电纺丝技术成功构建了具有缓释特性的AmB纳米纤维给药平台，体外释放72小时累积释放率达82%。动物实验表明该贴片可显著缩小病灶，疗效与葡萄糖酸锑钠(Glucantime?)和西纳两亲霉素(SinaAmpholeish?)相当，且未观察到局部刺激或系统毒性，为CL的局部治疗提供了新策略。

　　

在热带与亚热带地区的众多公共卫生挑战中，皮肤利什曼病(Cutaneous Leishmaniasis, CL)因其高发病率和现有疗法的局限性而备受关注。这种由利什曼原虫引起的寄生虫病，每年导致全球数十万新发病例，尤其在伊朗等中东地区流行严重。长期以来，葡萄糖酸锑钠(Meglumine Antimoniate, Glucantime^?)作为一线治疗药物，因其严重肾毒性、需要长期注射给药以及日益增长的耐药性问题，临床应用受到极大限制。两亲霉素B(Amphotericin B, AmB)虽对利什曼原虫具有高度活性，但传统静脉给药方式伴随发热、寒战等系统毒性，且稳定性差、生物利用度低，使其在CL治疗中难以推广。这些治疗困境促使研究人员寻求更安全、有效的局部给药新方案。

在此背景下，纳米技术为药物递送带来了革命性突破。特别是静电纺丝(Electrospinning)技术制备的纳米纤维，因其高比表面积、可调控孔隙结构以及与细胞外基质相似的特性，成为经皮给药的理想平台。德黑兰医学科学大学的研究团队在《Parasitology Research》发表的最新研究中，开发了一种载有AmB的壳聚糖(Chitosan)/明胶(Gelatin)/聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol, PVA)纳米纤维贴片，旨在通过局部给药方式实现CL的高效低毒治疗。

研究人员采用双喷头静电纺丝技术构建纳米纤维贴片，通过扫描电镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和X射线衍射(XRD)进行材料表征，利用MTT法评估细胞毒性，并通过BALB/c小鼠CL模型验证治疗效果。主要技术方法包括：采用双喷头静电纺丝技术分别处理酸性壳聚糖/明胶溶液和中性PVA/AmB溶液以避免药物降解；使用SEM分析纤维形貌；通过FTIR和XRD研究材料化学结构和结晶性；采用MTT法检测人真皮成纤维细胞(HDF)和THP-1单核细胞活力；建立L. major感染的BALB/c小鼠模型评估病灶缩小情况和寄生虫负荷。

纳米纤维制备与表征

研究团队通过优化静电纺丝参数，成功制备出直径均匀(176±15 nm)、表面光滑无串珠的纳米纤维。

纤维直径分布分析显示大多数纤维集中在150-200 nm范围，载药前后纤维形态无显著差异。FTIR光谱证实AmB成功包载于纳米纤维中，主要吸收峰出现展宽和轻微位移，表明药物与聚合物基质间存在氢键相互作用。XRD分析显示载药纳米纤维结晶度明显降低，呈现典型无定形特征，这种结构特性有利于药物的控制释放。

力学性能与载药特性

纳米纤维膜表现出良好的机械性能：拉伸强度1.66±2.49 MPa，断裂伸长率1.34%，弹性模量230.17±177.64 MPa，断裂能0.95 J，表明其具备足够的柔韧性和强度以适应皮肤贴附需求。载药量测定显示药物分布均匀，单位面积载药量为18.18±0.12 μg/cm²，为后续剂量设计提供了精确依据。

体外药物释放曲线

在模拟CL病灶环境(pH 6.7, 37°C)的释放研究中，纳米纤维呈现典型双相释放模式：前10小时快速释放达58%，随后持续缓释至96小时累计释放93.4%。这种释放特性有利于快速起效并维持长期疗效，符合局部治疗的需求。

体外生物学评价

细胞毒性实验显示，纳米纤维包载显著降低了AmB的急性毒性。在THP-1细胞中，游离AmB的24小时IC₅₀为17.73±4.44 μg/mL，48小时降至4.54±1.06 μg/mL；而载药纳米纤维的IC₅₀分别为28.38±7.23 μg/mL(24 h)和15.65±3.22 μg/mL(48 h)，毒性显著降低。在人真皮成纤维细胞(HDF)中同样观察到类似趋势，纳米纤维组IC₅₀值较游离药物提高约5倍，表明纳米纤维载体有效缓解了AmB的细胞毒性。

细胞内无鞭毛体抑制实验

载药纳米纤维对L. major细胞内无鞭毛体表现出明显的尺寸依赖性抑制作用。3×3 cm²和2×2 cm²贴片在48小时分别达到86%和69%的寄生虫抑制率，而小于0.5×0.5 cm²的贴片因药物释放不足甚至出现寄生虫增殖现象。所有剂量游离AmB(≥2.5 μg)在48小时均可完全清除寄生虫，空白纳米纤维仅产生短暂抑制作用，证实疗效主要来自AmB的持续释放。

体内治疗效果评估

短期(21天)治疗结果显示，隔日应用AmB纳米纤维贴片组病灶缩小效果与每日两次西纳两亲霉素组相当，均显著优于空白贴片和未治疗组。长期(63天)观察中，每周一次AmB纳米纤维贴片可持续抑制病灶发展，疗效与西纳两亲霉素无统计学差异。值得注意的是，空白纳米纤维组在42天后也出现一定疗效，可能与壳聚糖的免疫调节和伤口愈合促进作用有关。

寄生虫负荷半定量评估显示，AmB治疗组(纳米纤维贴片和西纳两亲霉素)寄生虫数量从中等(++)降至低水平(+)，而空白贴片和对照组则进展为高水平(+++/++++)感染，进一步验证了载药纳米纤维的治疗效果。

本研究通过系统评价证实，电纺壳聚糖/明胶/PVA载AmB纳米纤维贴片具有良好的生物相容性、可控释放特性和显著抗利什曼活性。与传统注射给药相比，该局部给药系统有效降低了系统毒性，提高了治疗安全性。每周一次的用药方案与现有每日两次的外用制剂疗效相当，极大提升了治疗便利性。纳米纤维的三维结构不仅为药物缓释提供理想平台，其类似细胞外基质的特性还可能促进伤口愈合，对CL复杂的病理环境具有多重改善作用。

尽管在动物模型中取得显著成效，研究人员也指出本研究存在一定局限性：实验采用急性感染小鼠模型，与人类CL慢性化特征存在差异；未进行免疫因子(如IFN-γ、IL-10)检测，难以全面阐释作用机制；更高载药量的可行性有待探索。未来研究可聚焦于慢性模型验证、免疫机制探讨以及给药方案优化，为推动该纳米纤维贴片向临床应用转化提供更充分证据。

这项研究为CL治疗提供了创新性解决方案，展示了纳米技术在寄生虫病治疗领域的巨大潜力。通过局部给药实现高效低毒的治疗效果，不仅有望改善患者依从性，对资源有限地区更具实用价值。随着后续研究的深入，这种纳米纤维给药平台或将成为CL治疗体系中的重要补充，为其他皮肤寄生虫病的治疗提供新思路。