cFLIP通过抑制caspase-8 D387A同源二聚体驱动的caspase-1/MLKL非依赖性围产期致死性调控肠道稳态

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：cFLIP suppresses caspase-1- and MLKL-independent perinatal lethality driven by auto-processing impaired caspase-8 D387A

本研究针对自剪切缺陷型caspase-8 D387A突变体在cFLIP缺失背景下引发围产期死亡的机制展开探索。研究人员通过构建多基因敲除小鼠模型，发现caspase-8 D387A与cFLIP形成的异源二聚体可介导外源性凋亡，而cFLIP缺失导致caspase-8 D387A同源二聚体异常激活FADD-RIPK1信号轴，进而触发caspase-1非依赖性的肠道萎缩和炎症基因表达。该研究揭示了cFLIP在平衡caspase-8同源/异源二聚体功能中的关键作用，为自身免疫及肠道疾病治疗提供新靶点。

　　

在细胞程序性死亡的复杂调控网络中，caspase-8作为关键分子，既参与外源性凋亡的启动，又抑制坏死性凋亡的发生。然而，当caspase-8的自剪切功能受损时，其生理功能如何维持？cFLIP（细胞FLICE样抑制蛋白）在这一过程中扮演何种角色？这些问题的答案对于理解自身免疫疾病和肠道炎症的发病机制至关重要。以往研究表明，表达自剪切缺陷突变caspase-8 D387A的小鼠（Casp8^D387A/D387A）不会出现淋巴增生性疾病，这被归因于caspase-8与cFLIP形成的异源二聚体仍具备部分蛋白酶活性。但若同时缺失cFLIP，这一平衡将被打破，导致胚胎期致死。本研究通过构建多基因修饰小鼠模型，深入揭示了cFLIP缺失背景下caspase-8 D387A同源二聚体驱动围产期死亡的分子机制。

研究人员主要运用了基因编辑技术（CRISPR/Cas9）构建Casp8^D387A/D387A、Cflar^-/-、Mlkl^-/-等多基因敲除小鼠模型，通过对胚胎及成年小鼠的表型分析、组织切片染色、蛋白质免疫印迹（Western blot）、RNA测序（RNA-seq）、流式细胞术及细胞死亡检测等手段，系统评估了肠道萎缩、炎症因子表达、细胞死亡通路激活等关键指标。

cFLIP缺失导致Casp8^D387A/D387A小鼠围产期死亡

研究首先发现，Casp8^D387A/D387ACflar^-/-小鼠在胚胎期第10.5天（E10.5）死亡，并伴随卵黄囊血管结构破坏，这一表型与Casp8^-/-小鼠相似。进一步实验表明，该死亡由MLKL依赖的坏死性凋亡驱动，因为同时敲除Mlkl可挽救胚胎存活至围产期。然而，Casp8^D387A/D387ACflar^-/-Mlkl^-/-小鼠在出生后5-7天内全部死亡，表现为小肠和胸腺萎缩，以及肠道内IL-6、CXCL9等炎症因子显著升高。

肠道炎症基因表达与caspase-1无关

RNA-seq分析显示，Casp8^D387A/D387ACflar^-/-Mlkl^-/-小鼠肠道中有4323个基因表达异常，包括Ccl5、Cxcl10、Zbp1等炎症相关基因。尽管caspase-1缺失可部分降低IL-1β等因子表达，但Cxcl10、Zbp1等基因的升高并不依赖caspase-1或I型干扰素信号通路。此外，肠道组织中检测到caspase-3/7剪切和GSDMD活化，但caspase-1敲除并不能挽救肠道萎缩或围产期死亡，表明存在caspase-1非依赖的细胞死亡机制。

caspase-8 D387A/cFLIP异源二聚体介导外源性凋亡

为明确caspase-8 D387A的活性依赖形式，研究者在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中进行了凋亡诱导实验。在抑制坏死性凋亡（使用RIPK3抑制剂GSK'843）后，Casp8^D387A/D387AMEFs仍可发生TNF/BV6诱导的凋亡，但该能力在Cflar敲除后完全丧失。进一步实验表明，caspase-8 D387A/cFLIP异源二聚体具有蛋白酶活性，可剪切RIPK1和caspase-3，而cFLIP缺失导致caspase-8 D387A同源二聚体异常聚集，并介导低水平底物剪切。

FADD-RIPK1-caspase-8 D387A复合物驱动NF-κB活化

免疫共沉淀实验证实，Cflar缺失促进FADD、RIPK1与caspase-8 D387A形成复合物，进而激活NF-κB信号通路，诱导Ccl5、Cxcl10等趋化因子表达。该过程依赖RIPK1的支架功能而非激酶活性，因为RIPK1催化失活突变体（Ripk1^D138N/D138N）仅部分抑制基因表达。

FADD敲除挽救围产期死亡但引发淋巴增生

最终，研究通过遗传学实验证明，FADD的完全缺失可挽救Casp8^D387A/D387ACflar^-/-Mlkl^-/-小鼠的围产期死亡，但成年后出现脾肿大、淋巴结增生及B220⁺CD3⁺T细胞累积，模拟了人类自身免疫淋巴增生综合征（ALPS）表型。这表明FADD介导的caspase-8 D387A活化是围产期死亡的核心机制，但其缺失会引发代偿性免疫紊乱。

结论与意义

本研究系统阐明了cFLIP通过调控caspase-8 D387A同源与异源二聚体活性，在维持肠道稳态和抑制围产期死亡中的关键作用。一方面，caspase-8 D387A/cFLIP异源二聚体具备凋亡诱导能力，可预防淋巴增生；另一方面，cFLIP缺失导致caspase-8 D387A同源二聚体通过FADD-RIPK1轴异常激活，触发caspase-1/MLKL非依赖的肠道萎缩和炎症反应。该研究不仅深化了对caspase-8功能多样性的理解，还为炎症性肠病和自身免疫疾病的治疗提供了新的分子靶点。论文发表于《Cell Death & Differentiation》，为细胞死亡领域的研究提供了重要理论依据。