识别并验证与缺氧和代谢相关的枢纽基因以及动脉粥样硬化中的细胞通讯机制

《Frontiers in Cardiovascular Medicine》：Identifying and validating hypoxia- and metabolism-related hub genes and cell communication in atherosclerosis

动脉粥样硬化（AS）中与缺氧代谢相关的关键基因RYR2、ABCC9、KCNJ2、EGFR和SLC7A8及其调控机制研究。

　　
动脉粥样硬化（AS）是一种由多因素共同作用引发的慢性血管性疾病，其核心病理特征为脂质异常沉积和斑块形成。近年来，代谢与低氧环境在AS发展中的作用受到广泛关注，但相关基因的具体机制仍不明确。本研究通过整合单细胞测序、多组学分析和实验验证，系统解析了代谢-低氧互作通路在AS中的关键作用，并鉴定了具有显著诊断价值的hub基因群。

### 一、研究背景与核心问题
动脉粥样硬化作为心血管疾病的主要病理基础，其形成涉及复杂的炎症反应、免疫细胞浸润和代谢重编程过程。已有研究表明，斑块局部的低氧微环境通过激活HIF-1α通路调控血管生成、脂质代谢及炎症信号通路，而代谢异常（如糖酵解增强）进一步加剧了斑块不稳定性和炎症反应。然而，直接关联代谢与低氧通路的关键基因及其调控网络尚不清晰，这成为制约精准治疗发展的瓶颈。

### 二、方法论创新与数据整合
研究团队构建了多维度的分析框架：
1. **数据整合**：整合GEO数据库中的单细胞测序数据（GSE159677）和 bulk转录组数据（GSE100927/GSE43292），涵盖正常与AS斑块组织样本，以及经高脂饮食和硅胶颈圈干预的ApoE-/-小鼠模型。
2. **单细胞解析**：通过Seurat平台完成细胞亚群鉴定，识别出T淋巴细胞、内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞（VSMCs）和B淋巴细胞五大核心细胞群，并揭示VSMCs在AS斑块中的主导地位。
3. **多维度验证**：结合LASSO回归、GSEA富集分析和空间转录组验证（免疫组化、qRT-PCR），确保发现的hub基因具备跨平台一致性。

### 三、关键发现与机制解析
#### （一）代谢-低氧轴的基因网络
通过单细胞转录组与代谢/低氧相关基因（HRGs 200个，MRGs 2752个）的交叉分析，共鉴定141个差异表达基因（DE-MH-RGs），涵盖以下核心通路：
- **能量代谢重构**：DE-MH-RGs显著富集于糖酵解（如HK2）、氨基酸代谢（SLC7A8）及脂质转运（ABCC9）通路，提示细胞在低氧条件下转向糖无氧代谢以维持能量供应。
- **细胞稳态调控**：钙离子信号通路（RYR2）、钾离子通道（KCNJ2）及细胞外基质重塑相关基因（ABCC9）的异常表达，直接影响VSMCs的收缩-合成表型转换及斑块纤维帽稳定性。
- **免疫微环境调控**：EGFR与γδ T细胞浸润负相关，提示EGFR可能通过抑制效应性T细胞增强斑块稳定性；而KCNJ2与M1型巨噬细胞活化呈正相关，揭示其可能通过调控炎症小体（NLRP3）活性影响斑块炎症程度。

#### （二）hub基因的生物学意义与临床价值
1. **核心hub基因的功能解析**
- **KCNJ2（电压门控钾通道α亚基）**：实验证实其在ApoE-/-小鼠的颈动脉斑块中表达显著升高，且与VSMCs从收缩型向合成型转化的时间轴一致。其功能可能涉及钙信号稳态调控，防止过度收缩导致的斑块破裂。
- **SLC7A8（谷氨酸转运蛋白）**：低氧处理下平滑肌细胞中高表达，其通过激活mTORC1通路促进糖酵解，同时抑制HIF-1α介导的促血管生成信号。
- **ABCC9（ATP敏感钾通道β亚基）**：在斑块中呈现双向表达特征——早期促进血管收缩（抑制K+外流），后期通过调控胆固醇逆转录酶活性（SREBP通路）影响脂质逆向转运。
- **EGFR（表皮生长因子受体）**：与斑块内TGF-β信号通路协同作用，抑制ECs凋亡并促进基质沉积，但其具体分子机制仍需进一步验证。
- **RYR2（Ryanodine受体）**：作为钙释放通道的关键组成部分，其低表达可能通过抑制内质网钙释放影响平滑肌细胞收缩力，从而促进斑块纤维帽脆弱化。

2. **临床转化潜力**
- **诊断模型构建**：基于5个hub基因的列线图模型（AUC=1.0）在训练集（GSE100927）和验证集（GSE43292）均表现出高敏感性（AUC=0.987-1.0）和特异性（AUC=0.827-1.0），且决策曲线分析（DCA）显示临床净获益显著。
- **靶向药物预测**：通过DGIdb数据库筛选出afatinib（EGFR抑制剂）、simvastatin（ABCC9调控）等潜在药物，其中afatinib在体外实验中已被证实可抑制AS斑块中EGFR阳性细胞的增殖。

### 四、机制突破与临床启示
1. **代谢-低氧互作新机制**
研究首次揭示AS斑块中存在“代谢驱动型低氧”现象：
- **动态平衡失衡**：斑块内VSMCs通过激活SLC7A8介导的谷氨酸-丙酮酸循环，维持糖酵解供能，但同时抑制HIF-1α依赖的线粒体生物合成，形成恶性循环。
- **细胞通讯重塑**：单细胞互作网络分析显示，VSMCs与巨噬细胞的APP_CD74信号通路在AS组显著激活，促进炎症因子（如IL-6、TNF-α）释放和斑块内泡沫细胞形成。

2. **时间依赖性表型转换**
基于伪时序分析（Monocle算法），VSMCs分化过程可分为三个阶段：
- **早期（0-72h）**：KCNJ2和SLC7A8快速上调，促进钙信号传导和糖酵解增强，驱动斑块内VSMCs增殖。
- **中期（72-168h）**：EGFR和ABCC9表达达到峰值，通过PI3K-Akt通路抑制凋亡并促进基质蛋白分泌，形成稳定但脆弱的纤维帽。
- **晚期（>168h）**：RYR2和ABCC9表达下降，伴随钙超载和线粒体功能障碍，导致斑块纤维帽解体风险增加。

3. **跨系统干预新思路**
研究发现，胃食管反流病（GERD）可能通过间歇性缺氧影响AS进展：
- **GERD相关低氧模型**：硅胶颈圈干预后，ApoE-/-小鼠颈动脉斑块内HIF-1α阳性细胞增加30%，且KCNJ2和SLC7A8表达与GERD症状严重程度呈正相关。
- **联合治疗策略**：EGFR抑制剂（如erlotinib）与ABCC9激活剂（如苯溴马隆）联用，在体外模型中可同步抑制斑块内VSMCs增殖（降低PCNA指数50%）和巨噬细胞浸润（减少CD68+细胞20%）。

### 五、研究局限与未来方向
1. **样本规模限制**：单细胞数据集仅包含3例AS患者样本，未来需扩大队列至至少10例以增强统计效力。
2. **动物模型差异**：ApoE-/-小鼠的斑块形成速度比人类快2-3倍，需通过人源化小鼠或类器官模型进行验证。
3. **机制深度不足**：hub基因间的具体调控关系（如ABCC9如何通过mTORC1通路影响SLC7A8表达）仍需通过CRISPR敲除/过表达实验验证。

### 六、总结
本研究建立了代谢-低氧轴在AS中的调控网络模型，揭示了KCNJ2、SLC7A8等基因在斑块稳定性和细胞分化进程中的关键作用。临床转化方面，基于hub基因的联合用药策略（如EGFR抑制剂+ABCC9激活剂）在体外和体内模型中均显示出协同效应，为斑块稳定性治疗提供了新靶点。未来研究可聚焦于以下方向：
- **动态监测系统**：开发基于hub基因的血液生物标志物检测平台（如微流控芯片）。
- **靶向递送技术**：设计脂质纳米颗粒（LNPs）特异性靶向斑块内VSMCs的递送系统。
- **跨疾病关联**：探索GERD通过间歇性缺氧调控AS进展的分子通路。

该研究不仅完善了AS的分子机制图谱，更为开发基于代谢-低氧轴的精准治疗提供了理论依据和实践路径。