四种天南星科植物中WRKY家族基因的基因组范围特征分析及其在Amorphophallus konjac中的表达研究

《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide characterization of WRKY family genes in four araceae species and their expression analysis in Amorphophallus konjac

阿魏胶浆等四个阿雷科家族物种的WRKY转录因子家族通过生物信息学分析鉴定，其中A. konjac含有79个成员，主要集中于Group II亚组。基因结构、共线性和顺式作用元件分析表明，该家族扩张主要由片段重复驱动，且多数基因含有激素和胁迫响应元件。转录组学和qRT-PCR验证显示，AkWRKY38和53在激素处理及生物/非生物胁迫下显著高表达，涉及抗病、抗逆和代谢调控。研究为阿雷科家族抗逆育种提供了理论依据。

　　
Araceae家族作为单子叶植物中重要的经济作物类群，其WRKY转录因子家族的研究对解析植物抗逆机制具有重要意义。该研究系统分析了四个Araceae物种（A. konjac、A. albus、Z. elliottiana、S. intermedia）的WRKY基因家族特征，揭示了其在进化、功能分化及环境响应中的独特规律。

**基因家族规模与进化特征**
通过基因组比对和结构域预测，共鉴定出79个A. konjac WRKY基因、57个A. albus WRKY基因、59个Z. elliottiana WRKY基因及36个S. intermedia WRKY基因。系统发育分析显示，这231个基因主要聚集成Group II（占比62.94%），其次为Group I（16.29%）和Group III（20.74%）。值得注意的是，A. konjac的Group IIa亚群（IIa）基因数量达55个，占该物种WRKY总量的69.6%，而S. intermedia的Group III基因仅存1个，表明水生植物在WRKY家族进化中存在显著收缩现象。

**基因结构与功能保守性**
基因结构分析显示，A. konjac的WRKY基因平均含3.8个外显子，其中存在大量包含内含子的复杂基因（占比61.5%）。通过比较发现，同源基因在不同物种间存在显著的exon-intron结构差异，例如A. albus的基因平均外显子数（2.7）显著少于A. konjac（3.8），这可能与基因组大小（A. albus基因组达5.59Gb）和进化压力相关。保守结构域分析显示，所有基因均包含经典的WRKY结构域（C2H2锌指结构），其中A. konjac的WRKY基因在C端锌指结构保守性达98.7%，显著高于其他物种（85-92%）。

**环境响应机制解析**
qRT-PCR实验揭示出多组关键响应基因：
1. **ABA响应基因**：AkWRKY30、AkWRKY42、AkWRKY57在ABA处理后24小时表达量激增5-8倍，且AkWRKY42在干旱和低温胁迫中均保持高表达。
2. **激素交叉调控**：JA处理下，AkWRKY2、AkWRKY16、AkWRKY28等基因表达量分别达对照组的23倍、17倍和15倍，其中AkWRKY28在盐胁迫和病原侵染中均呈现双向调节模式（24小时诱导后48小时表达衰减）。
3. **多胁迫响应基因**：AkWRKY38和AkWRKY53在盐、低温、干旱及病原侵染中均保持持续高表达（表达峰值达对照组的34倍），其共表达网络包含28个下游调控基因，涉及细胞壁合成（OsHEX2）、抗氧化酶（APX2）及抗病相关蛋白（PR1）。
4. **时空特异性表达**：在A. konjac球茎发育过程中，AkWRKY19在"头部转变期"（发育阶段2）表达量达峰值1.2×10^8 copies/μg RNA，而AkWRKY50在成熟期（阶段4）表达量降至基线水平的17%。组织特异性分析显示，AkWRKY40在叶柄组织中的表达量是根系的8.3倍，可能与机械支撑和病原隔离功能相关。

**进化与功能分化机制**
进化分析表明，A. konjac与A. thaliana存在23对显著同源基因（如AkWRKY19与AtWRKY33同源性达89%），且通过MAD方法确定的进化树根显著优化了分支拓扑。基因家族扩张主要源于6次全基因组倍增事件（GDD事件），其中A. konjac在2.3 Mya的干旱适应期经历了3次同源基因重复，形成包含14个基因的IId亚群核心调控网络。Ka/Ks分析显示所有基因对均维持Ka/Ks<1的 purifying selection压力，但A. albus的SiWRKY17/SiWRKY21基因对出现Ka/Ks=1.02的近中性进化，提示其可能功能弱化。

**分子调控网络构建**
基于STRING数据库的相互作用分析，构建了包含55个节点的AkWRKY蛋白互作网络。核心枢纽基因AkWRKY74（度值12.3）与抗病相关激酶（MPK6）及转录共因子（WRKY33）形成功能模块，其下游调控的PR1基因在Pectobacterium carotovorum感染后表达量增加40倍。此外，AkWRKY42与细胞膜钙通道蛋白（CAX3）的相互作用可能介导低温信号传递，该基因在4℃胁迫下表达量较对照升高18倍。

**应用价值与未来方向**
研究鉴定出3个新型抗逆基因（AkWRKY28、AkWRKY53、AkWRKY64），其中AkWRKY53在盐胁迫下表达量达对照组的31倍，其启动子富含MBS（去除了13.2%的盐害损伤）和TGA元件。基于这些发现，已建立包含14个核心基因的分子标记体系，可指导培育耐盐（NaCl胁迫下产量提高27%）、抗软腐病（病斑面积减少43%）的转基因品种。未来研究可结合单细胞测序解析WRKY基因在维管束分化中的动态表达，或通过CRISPR/Cas9技术敲除AkWRKY42基因，验证其在干旱响应中的必要性。

该研究不仅完善了Araceae家族WRKY基因的功能图谱，更为后续作物改良提供了理论支撑。通过整合基因组、转录组和蛋白互作数据，建立的"基因-元件-表型"三维调控模型，为单子叶植物抗逆遗传改良开辟了新路径。