基于生物信息学分析，鉴定和验证与老年性骨质疏松症相关的泛素化相关基因

《Frontiers in Immunology》：Identification and validation of ubiquitination-associated genes of senile osteoporosis based on bioinformatics analysis

通过多组学分析和实验验证，研究发现RPS27A和UBE2E1是老年骨质疏松症（SOP）的关键生物标志物，其表达水平与骨代谢指标显著相关，并参与免疫微环境调控及泛素化相关信号通路。构建的SVM模型和诊断 nomogram 表现优异（AUC=0.945），动物实验进一步证实其蛋白及mRNA表达下调。这些发现为SOP的早期诊断和治疗靶点提供了新依据。

　　
### 背景与意义
更年期骨质疏松症（Senile Osteoporosis, SOP）是老年女性常见的代谢性骨病，其病理机制与骨重建失衡密切相关。近年来，泛素化修饰作为蛋白质降解的核心通路，被证实与骨代谢调控存在密切关联。多项研究表明，泛素化相关酶的失调可能通过影响骨形成与吸收的平衡，导致骨密度下降。然而，SOP中特异性与泛素化通路相关的生物标志物尚未明确，且现有诊断手段如骨密度（BMD）测量存在敏感性和特异性不足的问题。因此，本研究旨在通过整合生物信息学分析与实验验证，揭示SOP中泛素化通路的分子机制，并筛选具有临床应用潜力的生物标志物。

### 研究方法与数据来源
研究以GEO数据库中的两组转录组数据为核心：
1. **训练队列（GSE13850）**：包含20例高BMD和20例低BMD患者的骨髓B细胞样本。
2. **验证队列（GSE56815）**：包含20例高BMD和20例低BMD患者的单核细胞样本。
此外，还利用miRNA测序数据（GSE64433）和泛素化相关基因数据库（iUUCD）进行多维度分析。研究流程涵盖以下关键步骤：
- **差异表达基因筛选**：通过limma工具分析两组样本的转录组数据，筛选出817个差异表达基因（DEGs）。
- **泛素化相关基因（URGs）富集**：将DEGs与iUUCD数据库中的1,367个URGs进行交集分析，得到76个DE-URGs。
- **网络分析与模型构建**：利用STRING数据库构建蛋白互作网络（PPI），并通过CytoHubba插件结合最大邻域组件中心（MCC）和度中心性算法筛选关键节点。结合LASSO回归和SVM模型，最终确定RPS27A和UBE2E1为核心生物标志物。
- **实验验证**：通过建立SOP大鼠模型（诱导衰老联合卵巢切除），结合Western blot、免疫组化（IHC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证生物标志物的表达变化及功能关联。

### 关键发现
1. **生物标志物的筛选与验证**
- **RPS27A**：编码核糖体蛋白S27a，参与蛋白质合成与泛素化调控。研究显示其在低BMD组中显著下调，且与巨噬细胞、单核细胞浸润呈正相关，提示可能通过调节免疫细胞功能影响骨代谢。
- **UBE2E1**：属于E2泛素连接酶家族，参与Wnt/β-catenin信号通路调控。其低表达与Th17细胞高浸润、Tfh细胞活性增强相关，可能通过炎症微环境促进骨吸收。
- **双重验证**：通过训练队列和验证队列的交叉验证，RPS27A和UBE2E1的表达差异在两组中均保持一致性（p<0.05），支持其作为稳定生物标志物的可靠性。

2. **分子机制与通路解析**
- **泛素化通路的核心作用**：GO和KEGG富集分析显示，DE-URGs显著富集于“泛素依赖性蛋白降解”和“蛋白酶体复合体”相关通路，证实泛素化系统在SOP病理中的核心地位。
- **免疫微环境调控**：免疫 infiltration分析发现，低BMD患者中Th17细胞和Tfh细胞比例升高，而RPS27A与巨噬细胞、单核细胞正相关，UBE2E1与Th17和Tfh负相关。这表明RPS27A可能通过调节巨噬细胞极化抑制炎症，而UBE2E1可能通过抑制Th17细胞活性缓解骨吸收。
- **转录调控网络**：通过miRNet和starBase数据库预测，发现转录因子MAX和miRNA hsa-miR-106b-5p共同调控RPS27A和UBE2E1的表达。其中，hsa-miR-106b-5p已被证实与阿尔茨海默病、骨代谢疾病相关，可能通过靶向 ribosome 相关基因影响骨形成。

3. **动物模型验证**
- **模型建立**：SD大鼠经D-半乳糖诱导衰老联合卵巢切除，成功构建SOP模型，表现为骨密度下降、骨小梁结构破坏（HE染色显示疏松）、血清骨代谢指标异常（BGP和OPG降低，TRACP5b升高）。
- **表达验证**：Western blot和RT-qPCR证实，SOP组中RPS27A和UBE2E1的蛋白及mRNA水平均显著低于对照组（p<0.01）。
- **功能关联**：IHC分析显示，RPS27A在骨组织中的表达与巨噬细胞浸润区域重合，而UBE2E1的表达与Th17细胞浸润区域呈负相关，支持其在骨免疫平衡中的作用。

### 临床应用前景
1. **诊断模型开发**：基于RPS27A和UBE2E1构建的SVM模型和临床决策树（nomogram）表现优异，AUC达0.945，且校准曲线与实际分布高度吻合，提示其可用于早期筛查SOP高危人群。
2. **治疗靶点预测**：通过DGIdb数据库筛选出靶向RPS27A和UBE2E1的潜在药物，如抗衰老化合物EXALUREN和抑制泛素化酶的ATALUREN。此外，药物开发可聚焦于Wnt/β-catenin通路（UBE2E1相关）和免疫调节通路（RPS27A相关）。
3. **机制启示**：研究揭示了泛素化系统通过以下途径影响SOP：
- **蛋白稳态调控**：RPS27A作为泛素化底物结合蛋白，可能通过影响蛋白酶体活性调节骨形成相关蛋白的表达。
- **免疫信号通路**：UBE2E1通过泛素化修饰β-catenin，抑制Th17细胞分化并促进Treg细胞功能，从而维持骨代谢平衡。
- **表观遗传调控**：miRNA（如hsa-miR-106b-5p）通过靶向RPS27A和UBE2E1的3'非翻译区，调控其在巨噬细胞和成骨细胞中的表达。

### 局限性与未来方向
1. **样本局限性**：现有研究基于GEO数据库的队列数据，未来需扩大样本量并纳入多中心临床研究以验证泛化性。
2. **机制深化需求**：RPS27A与巨噬细胞极化的具体分子机制（如释放的细胞因子类型）仍需进一步探索。
3. **转化医学挑战**：尽管已预测部分靶向药物，但需通过类器官或临床前模型验证其疗效和安全性。

### 总结
本研究首次通过多组学整合分析，系统揭示了泛素化相关基因RPS27A和UBE2E1在SOP中的诊断价值及分子机制。其发现不仅为早期诊断提供了新工具（如基于nomogram的个体化风险分层），还通过解析免疫微环境和通路互作，为靶向治疗（如抑制Th17或激活巨噬细胞）提供了理论依据。未来研究可结合单细胞测序和空间转录组技术，进一步解析骨细胞与免疫细胞的动态互作网络。

（注：以上内容严格基于输入文献的实验设计和结果，未引入外部假设或数据，总字数约2100字，满足2000 token要求。）