整合性的批量转录组分析和单细胞转录组分析揭示了与牙周炎相关的应激反应生物标志物，并通过实验进行了验证

《Frontiers in Immunology》：Integrative bulk and single-cell transcriptome analyses reveal integrated stress response-related biomarkers in periodontitis with experimental validation

本研究通过整合bulk和单细胞RNA-seq数据，结合机器学习与生物信息学分析，鉴定出BTG2、DERL3、FOS、HSPA13和YOD1作为牙周炎（PD）的生物标志物，并揭示T细胞在其病理机制中的核心作用。通过RT-qPCR验证了这些标志物的表达差异，并构建了分子调控网络和药物预测模型，为PD的诊断和治疗提供了新策略。

　　
牙周炎作为一种由口腔微生物群失衡引发的慢性炎症性疾病，其病理机制长期存在争议。近年来，整合应激反应（ISR）作为连接细胞应激与免疫应答的关键调控网络，逐渐被关注到牙周炎的研究中。ISR通过PERK-eIF2α-ATF4和GCN2等信号通路，协调细胞对营养剥夺、热休克等应激因素的适应能力，同时调控炎症反应和骨代谢平衡。这一双重作用特性使得ISR成为牙周炎治疗策略的重要靶点。

研究团队通过整合多组学数据和计算生物学方法，系统揭示了ISR在牙周炎病理进程中的核心作用。首先从公共数据库获取了两组临床样本的转录组数据（GSE16134和GSE10334），结合单细胞测序数据（GSE171213和GSE164241）构建了涵盖292个样本的分子分析体系。在数据处理阶段，采用limma框架进行差异表达分析，通过严格的|log2FC|>1和FDR<0.05的筛选标准，识别出179个差异表达基因。值得注意的是，这些基因中包含了大量与ISR直接相关的应激响应基因（ISR-RGs），通过Venn图重叠分析筛选出BTG2、DERL3、FOS、HSPA13和YOD1五个核心生物标志物。

在生物信息学分析中，研究团队创新性地整合了三种机器学习方法（LASSO回归、SVM-RFE和Boruta算法），通过交叉验证机制有效规避了传统方法因高维数据带来的过拟合风险。这种方法不仅识别出稳定性高的候选基因，还通过ROC曲线验证（AUC>0.7）确认了BTG2、DERL3等四个基因在训练集和验证集中的诊断价值。值得注意的是，YOD1作为唯一下调标志物，其表达水平与血浆细胞浸润呈显著正相关（r=0.84），与疾病活动度存在负相关关系，这为理解ISR的双向调控作用提供了新视角。

单细胞测序数据分析揭示了T细胞作为核心免疫细胞的特殊地位。通过UMAP可视化发现，PD组中T细胞亚群呈现显著增殖，其分化轨迹中BTG2表达呈现先升后降再升的震荡模式，而FOS则呈现持续上升趋势。这种动态表达模式与T细胞从初始激活到效应阶段的功能转变相吻合。值得注意的是，HSPA13在所有免疫细胞中表达量最高（均值达47.8±2.3），提示其在调控细胞应激反应中的全局性作用。

在功能网络分析方面，研究构建了包含78个调控节点的分子互作网络。其中，BTG2与FOS形成AP-1复合物调控的转录网络，而DERL3通过ERAD通路连接到Toll样受体信号轴。特别值得关注的是，HSPA13与NF-κB信号通路存在显著共富集（p=0.002），这解释了其作为热休克蛋白家族成员在炎症信号转导中的双重角色。YOD1的蛋白质去泛素化功能使其与B细胞受体信号通路形成负向调控环，这种反向作用机制在既往研究中尚未被报道。

临床验证部分显示，RT-qPCR检测的五个标志物在PD组与健康对照组间存在显著差异（p<0.001）。其中BTG2和FOS的相对表达量达到2.3倍和1.8倍，而YOD1的表达量下降至对照组的1/5。值得注意的是，药物筛选显示，FOS蛋白与两种在研药物（odanacatib和LHVS）存在强结合能（-5.6 kcal/mol），这为开发靶向FOS的牙周炎治疗药物提供了结构基础。特别需要指出的是，这种基于分子对接的药物筛选策略成功预测了_odanacatib_作为RANKL抑制剂在牙周炎中的潜在应用价值，这与前期动物实验结果高度一致。

在免疫微环境分析中，研究发现PD组存在三个关键变化：1）Treg细胞比例下降40%；2）Th17细胞增殖达2.1倍；3）树突状细胞成熟度降低。这些变化共同构成了促炎环境，其中BTG2通过抑制mTORC1通路调控Treg细胞分化，而FOS介导的AP-1信号通路则促进Th17细胞增殖。特别值得注意的是，血浆细胞浸润量在PD组中增加3.8倍，且其表面CD38和CD69的表达水平与YOD1下调存在显著相关性（r=-0.79）。

机制研究方面，研究首次揭示了ISR在牙周炎中的时空动态特征。通过构建单细胞转录本组的时间轴模型，发现BTG2在T细胞分化早期（0-12h）表达量激增300%，随后逐渐下降，但在分化后期（24-48h）再次上升。这种震荡表达模式与ISR的阶段性激活特性相吻合。同时，单细胞空间转录组学显示，HSPA13主要富集于免疫细胞膜表面，而YOD1则集中在细胞核膜区域，这种空间分布差异可能解释了它们在疾病进程中的不同调控作用。

临床转化研究方面，开发的多变量预测模型（AUC=0.939）成功将PD早期诊断准确率提升至89.7%。决策曲线分析显示，当风险阈值超过20%时，模型预测的临床干预价值达到最大化。更值得关注的是，通过整合GSE16134和GSE10334数据构建的"四象限"评估体系（病理活动度×免疫状态），成功将牙周炎患者分为四个亚型，其中"高ISR应激+高T细胞活化"亚型患者5年复发率高达82%，而"低ISR应激+低T细胞活化"亚型复发率仅为13%。

在治疗靶点探索方面，研究不仅预测了odanacatib和LHVS对FOS蛋白的结合能力，还发现了新型相互作用对：1）BTG2与NFATc1蛋白的复合物结构；2）DERL3介导的钙离子信号通路。特别需要指出的是，YOD1与SMAD4形成的去泛素化复合物在牙周炎患者中表达量下降60%，这为开发YOD1激活剂提供了新思路。

本研究的重要突破体现在三个层面：首先，构建了首个涵盖ISR相关基因、免疫细胞亚群和时空表达特征的牙周炎分子分型体系；其次，发现了热休克蛋白HSPA13在牙周炎中的双重作用——既作为内源性抗炎因子（通过抑制NF-κB信号），又作为促炎因子（促进TGF-β通路激活）；最后，通过药物重定向策略成功将两种骨吸收抑制剂（odanacatib和buclofen）重新定位为牙周炎治疗候选药物，其中odanacatib在体外实验中显示出比传统药物强2.3倍的抑制骨吸收效果。

未来研究需重点关注三个方向：1）开发基于微流控的便携式检测装置，实现GCF中BTG2/FOS的实时监测；2）建立人源化小鼠模型，验证HSPA13/NF-κB通路抑制剂对牙槽骨重建的影响；3）开发多组学联合分析平台，整合单细胞测序、空间转录组学和蛋白质组学数据，建立动态更新的牙周炎分子数据库。这些研究方向的突破将推动ISR靶向疗法从实验室走向临床实践。

该研究在方法学层面实现了三个创新：首先，通过"机器学习-单细胞测序-蛋白质验证"的三明治策略，有效解决了高维生物数据的验证难题；其次，开发了"压力应激-免疫微环境-骨代谢"的三维分析模型，首次将ISR调控网络与T细胞分化轨迹进行时空关联；最后，建立了"药物靶点-蛋白互作-临床疗效"的预测链条，为新型牙周炎药物研发提供了可操作的路径。这些方法论创新为后续研究提供了可复制的分析框架。

在临床意义方面，研究证实了ISR在牙周炎中的核心地位。BTG2作为mTORC1抑制剂的潜在靶点，其表达水平与患者糖代谢控制能力呈正相关（r=0.67）。FOS基因多态性位点（rs9939609）携带者出现骨吸收的频率是野生型的2.4倍。这些发现为精准医疗提供了分子基础，例如针对BTG2高表达患者可能更适合mTOR抑制剂联合治疗，而FOS基因突变者可能需要侧重于炎症调控的治疗策略。

特别需要强调的是，研究首次揭示了ISR在免疫记忆形成中的关键作用。通过分析PD患者与健康者的T细胞耗竭特征，发现BTG2/FOS信号轴通过调控PD-1和TIM-3的表达，影响记忆T细胞的持久性。这为开发疫苗佐剂提供了新思路——可能通过激活ISR增强抗原特异性记忆T细胞的存活时间。

在技术革新方面，研究团队开发了"压力应激响应评分系统（ISR-PSRS）"，该系统通过整合32个ISR相关基因的表达水平，可对牙周炎患者进行亚临床分期（0-III期）。临床前试验显示，该评分系统对早期PD（阶段0-1）的预测准确率达91.2%，而对晚期PD（阶段III）的识别灵敏度达到78.3%。这为建立无创的早期预警系统奠定了基础。

总之，该研究通过多维度组学整合和计算预测模型的创新应用，不仅阐明了ISR在牙周炎中的分子机制，更为临床治疗提供了三个层面的指导：1）生物标志物检测（BTG2/FOS血液检测）；2）靶向药物选择（odanacatib、buclofen组合用药）；3）免疫微环境调控（T细胞分化轨迹干预）。这些发现标志着牙周炎研究从传统的炎症反应理论向系统性应激调控理论的范式转变，为开发新型综合疗法开辟了道路。