《Journal of Controlled Release》：NQO1-responsive Trimethyl lock benzoquinone: A cleavable linker strategy for antibody-drug conjugates
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抗体偶联药物（ADC）中新型NQO1响应连接子NRTL-24的开发及在胶质瘤治疗中的应用研究。该连接子通过三甲基锁定苯醌结构实现血浆稳定性，在NQO1高表达肿瘤细胞中特异性释放微管抑制剂MMAE，对U251和T98G细胞显示高选择性毒性（IC50分别为0.03和0.06 nM），对正常细胞毒性降低超10,000倍。体内实验证实其显著延长生存期并降低副作用，为酶靶向ADC开发提供新策略。
王志豪|刘凯|尚超|闫向宇|董玉超|李大鹏|李一泉|张翠玲|任伟|马成元|王欢|李晓|范世勇|吴忠
国家应急药物工程技术研究中心，北京 100039，中国
摘要
抗体-药物偶联物（ADC）的疗效受到过早的全身性载荷释放和肿瘤激活不足的阻碍。本文开发了一种基于三甲基锁苯醌的NQO1响应性连接剂，用于制备针对胶质瘤的ADC NRTL-24。体外研究表明，NRTL-24在保持血浆稳定性的同时实现了依赖于NQO1的MMAE释放。它在EGFR/NQO1高表达的胶质瘤细胞（U251 IC50 = 0.03 nM；T98G IC50 = 0.06 nM）中表现出强大的细胞毒性，与游离MMAE相当（U251 IC50 = 0.01 nM；T98G IC50 = 0.02 nM）。值得注意的是，在EGFR/NQO1低表达的正常细胞（HMC3 IC50 = 0.58 mM）中，毒性显著降低，选择性指数超过10,000。体内实验显示，NRTL-24具有优异的肿瘤靶向能力，显著延长了生存期，同时保持了良好的安全性。这种NQO1响应性连接剂技术能够在肿瘤部位精确释放载荷，同时将脱靶效应降至最低，使NRTL-24成为一种有前景的治疗候选物。该策略为通过肿瘤选择性连接剂设计开发酶靶向ADC提供了蓝图。
引言
抗体-药物偶联物（ADC）结合了细胞毒性载荷的效力和抗体的特异性，能够将细胞毒性载荷选择性地递送到肿瘤部位[1]。ADC显著降低了细胞毒性载荷的全身毒性，提高了其治疗指数[[2], [3], [4]]。ADC代表了癌症治疗领域的革命性方法，与传统化疗相比，提供了更加精准和个性化的治疗方案[[5], [6], [7]]。过去二十年里，全球关于ADC的期刊文章和专利数量不断增加，表明人们对ADC的兴趣日益浓厚。2023年，全球ADC市场的价值为112.9亿美元，预计2024年至2030年间将以9.2%的复合年增长率增长[8,9]。作为ADC的关键组成部分，连接剂通过调节稳定性和载荷释放，在决定其药代动力学和疗效方面起着重要作用[5]。理想的ADC连接剂应在非肿瘤组织中保持稳定，并能在肿瘤部位通过酶（如组织蛋白酶B）或化学方式（如半胱氨酸、谷胱甘肽或溶酶体中的低pH值）被切割，从而特异性释放细胞毒性载荷[10]。目前的临床连接剂未能满足这些要求，主要存在的问题包括稳定性差、肿瘤特异性低和疏水性不足[[11], [12], [13]]。这些缺点导致载荷在循环系统中过早释放，并且在肿瘤部位的释放效率低下，只有少量药物能够到达肿瘤部位[14]，从而引发包括严重贫血、中性粒细胞减少症、周围神经病变、血小板减少症和肝毒性在内的脱靶毒性反应[15]。针对肿瘤组织和肿瘤微环境（TME）的独特特征已成为癌症治疗的有前景策略[16,17]。能够响应肿瘤组织和肿瘤微环境的可切割连接剂在癌症治疗中具有新颖性和高效性，可提高ADC的治疗效果并降低全身毒性。我们研究小组此前已经探索了TME响应性可切割ADC连接剂。此外，我们还开发了基于硅醚的酸切割连接剂[18]、基于对硝基苯基的缺氧敏感连接剂[19]和基于偶氮苯的缺氧敏感连接剂[20]。先前的研究证实，合理的连接剂设计是提高ADC疗效和安全性的关键。
三磷酸吡啶核苷酸NAD(P)H：醌氧化还原酶1（NQO1）是一种抗氧化酶，利用NADH或NADPH作为底物还原醌、偶氮和硝基化合物，保护细胞免受氧化应激[21,22]。肿瘤微环境具有多样的氧化还原电位，通过酶活性的差异表达诱导正常细胞的恶性转化和改变[23]。与邻近正常组织相比，NQO1在多种实体瘤中的表达显著上调：在超过80%的非小细胞肺癌中上调高达200倍，在超过80%的胰腺癌中上调高达100倍，在60%的前列腺癌、60%的乳腺癌和50%的结直肠癌中上调高达10倍[21,24]。对NQO1敏感的前药和纳米载体可以在NQO1高表达的癌细胞中迅速高效地释放治疗剂，最近的研究表明这些药物能够实现调控性释放，减少不良反应并提高疗效[[25], [26], [27], [28], [29]]。尽管NQO1响应性策略已广泛应用于前药和纳米载体，但尚未有NQO1响应性可切割连接剂用于ADC的开发。
在本研究中，我们使用了一种NQO1响应性可切割连接剂制备了新型ADC NRTL-24。NRTL-24在体外和体内实验中表现出良好的稳定性、选择性、肿瘤靶向能力和安全性（图1）。这些发现突显了基于三甲基锁苯醌的新型NQO1响应性连接剂的潜力，为ADC的开发提供了一个多功能平台。NRTL-24成为治疗胶质瘤的有希望的候选药物，也为酶靶向ADC的开发提供了更广泛的策略。
章节摘录
NQO1响应性连接剂-MMAE (M12) 的合成
NQO1响应性连接剂-MMAE (M12) 的实验方案和表征数据（包括NMR、HRMS）见补充信息。
NRTL-24 的制备
将西妥昔单抗（Merck，目录号C10009571）溶解在L-组氨酸缓冲液（20 mM，pH ≈ 7.5）中，并用三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP·HCl）溶液（相对于西妥昔单抗为2.5当量）处理60分钟，以减少抗体链间的二硫键。M12（相对于西妥昔单抗为8当量）溶解在...
NQO1响应性连接剂和NRTL-24的合理构建
在本研究中，引入了一种新型的NQO1响应性三甲基锁苯醌作为抗体-药物偶联物的可切割连接剂。虽然NQO1的底物包括醌、偶氮和硝基化合物，但由于其优异的选择性和高效的药物释放能力，三甲基锁苯醌丙酸是最常用的NQO1响应性结构[32,33]。为了构建三甲基锁结构，苯醌环上的丙酸取代基的β-碳被进行了双取代...
结论
在本研究中，我们设计了一种NQO1响应性连接剂。该连接剂巧妙地源自三甲基锁苯醌结构。在健康组织中，由于NQO1的水平较低，三甲基锁结构保持稳定状态，有效防止了载荷的过早释放，保护正常细胞免受其细胞毒性作用。而在NQO1过表达的肿瘤组织中，连接剂中的醌基团...
CRediT作者贡献声明
王志豪：撰写——原始草案、方法学、研究、数据整理。刘凯：撰写——原始草案、方法学、研究、数据分析。尚超：方法学、研究。闫向宇：撰写——原始草案、方法学、研究。董玉超：方法学、研究。李大鹏：方法学、研究。李一泉：方法学、研究。张翠玲：方法学、研究。任伟：方法学、研究。马成元：验证、数据
