来自摩洛哥苹果园的昆虫病原真菌：针对苹果蠹蛾（Cydia pomonella）的新生物防治候选菌的分子和酶学特性研究

梨小食心虫（Cydia pomonella）作为全球重要经济果树害虫，其抗药性加剧了化学防治的局限性。本研究从摩洛哥感染虫尸中分离出7株EPF真菌（Aspergillus tubingensis、A. niger、Penicillium olsonii等），通过实验室毒力测试发现：1×10?孢子/mL时，A. tubingensis（75.4%）和P. olsonii（76.6%）对两种虫群的死亡率显著高于商业B. bassiana菌株（BEA1最高76.5%），且酶活性（脂酶12.4-15.3mm，蛋白酶12.4-15.3mm）与基因（beauvericin、PKS、GGPP synthase）表达呈正相关。代谢可塑性测试显示Aspergillus属真菌对葡萄糖/木糖利用率达100%，而Penicillium属为65-98%。研究证实本土EPF真菌（如A. tubingensis、P. olsonii）兼具高效酶解能力与代谢多样性，为开发抗性环境下的生物农药提供了新资源。

　　
本研究聚焦于利用本土昆虫病原真菌（Entomopathogenic Fungi, EPF）防控卷叶蛾（*Cydia pomonella*）这一经济作物的主要害虫。研究团队从摩洛哥费斯-梅克内斯地区的苹果园采集感染昆虫的残体，通过标准化分离流程获得11株本土真菌，并对其致病性、酶活性及遗传特征进行系统评估。实验采用双虫种（来自不同地理区域的卷叶蛾种群）的对照实验，结合商业生物农药（*Beauveria bassiana*）作为阳性对照，从多维度验证候选真菌的生物防治潜力。

### 研究背景与核心问题
卷叶蛾作为全球苹果主产区的重要经济威胁，其抗药性已导致传统化学防治效果显著下降。研究团队发现，尽管已有文献报道*Beauveria bassiana*等商业化真菌的有效性，但针对摩洛哥本地种群的环境适应性及作用机制仍缺乏系统研究。本研究通过从自然感染昆虫残体中分离EPF，旨在筛选出具有地域适应性的高效菌株，同时解析其作用机理。

### 关键实验设计与发现
1. **真菌分离与纯化**
采样区域涵盖费斯-梅克内斯农业研究中心的多个果园，采集时间集中在2024年生长季。通过改进的CTAB法提取真菌基因组DNA，结合ITS序列分析确认物种组成，最终获得7株候选真菌：*Aspergillus tubingensis*（2株）、*Aspergillus niger*（2株）、*Penicillium olsonii*、*Penicillium glabrum*和*Penicillium thomii*。其中，*A. tubingensis*和*P. olsonii*在实验室毒力测试中表现尤为突出。

2. **致病性评估体系**
实验采用三浓度梯度（10?、10?、10?孢子/mL）对两组卷叶蛾幼虫进行离体测试。结果显示：
- **剂量效应显著**：最高浓度（10?孢子/mL）下，所有菌株的死亡率均达60%以上，且死亡率随浓度增加呈指数上升。例如，商业菌株BEA1在10?浓度下对种群1和2的死亡率分别达86.9%和76.5%。
- **本土菌株竞争力**：*A. tubingensis* ASP1在种群1中实现75.4%死亡率，*P. olsonii* PO在种群2中达76.6%，均超过另一商业对照BEA2的效能（61.7%）。部分菌株如ASP3和ASPC1的LD??值（剂量50%死亡率）接近BEA1（6.41×10? vs 3.89×10?孢子/mL），表明其具有与商业化菌株相当的毒力。

3. **酶活性与代谢适应性分析**
通过特异性培养基检测发现：
- **水解酶协同作用**：高效菌株普遍表现出多酶协同降解能力。例如，*A. tubingensis* ASP1的脂酶、蛋白酶和磷脂酶活性分别达12.7mm、12.7mm、5.2mm，而*Aspergillus niger*的酶活性更高（15.3mm脂酶/蛋白酶，11.6mm磷脂酶），这与其在破坏卷叶蛾外骨骼蜡质层和蛋白质结构方面的高效性直接相关。
- **碳代谢多样性**：*Aspergillus*属菌株（ASP1、ASP3、ASPC1、ASPC2）在葡萄糖和木糖培养基中均保持100%生长率，表明其具备代谢灵活性和快速利用不同碳源的能力。相比之下，*Penicillium*属菌株（PT、PO、PG）的代谢适应性较弱（65%-73%），但通过机械性穿透外骨骼仍能维持较高致病性。

4. **基因簇与生物活性关联性**
PCR检测显示：
- **毒素合成基因**：所有*Penicillium*菌株均携带*bauA*基因（编码 beauvericin毒素），而*Aspergillus*属中仅ASP1和ASPC1携带该基因。这解释了为何在相同浓度下，*P. olsonii* PO的死亡率显著高于 counterpart *A. tubingensis*。
- **次生代谢途径差异**：*Penicillium*属菌株均携带GGPP合成酶基因（关键于萜类毒素前体合成），而*Aspergillus*属中仅ASP1和ASPC1具有此基因。结合酶活性数据，推测*P. olsonii*的高效性可能源于其独特的毒素组合（如环孢菌素类化合物）。

### 创新性突破与机制解析
研究首次证实*Penicillium olsonii*对卷叶蛾的强效性，其LD??值（90%死亡率剂量）为1.01×101?孢子/mL，与BEA1相当。机制分析表明：
1. **复合感染策略**：*Aspergillus*属菌株通过多酶协同作用快速突破外骨骼屏障，而*Penicillium*属则依赖机械损伤结合毒素作用。例如，*A. niger*的磷脂酶活性达11.6mm，显著高于其同类真菌。
2. **环境适应性进化**：本土菌株ASP1和PO的酶活性水平接近商业菌株，但代谢适应性更强（100%在双碳源中生长），这与其长期暴露于地中海气候（冬季低温、夏季干燥）的进化背景相关。
3. **基因功能补偿**：尽管部分菌株缺失*bauA*或*pks*基因，但通过其他途径（如nrps基因簇的补偿表达）仍能维持有效致病性，提示多基因协同调控的重要性。

### 实际应用价值与后续方向
研究证实，本土EPF菌株在成本效益（无需进口）、环境友好性（无化学残留）和抗药性规避方面具有显著优势。建议优先开发ASP1（*A. tubingensis*）和PO（*P. olsonii*）菌株，因其兼具高酶活性与完整毒素合成基因簇。后续研究可聚焦于：
- **田间持效期优化**：当前实验室数据显示10?孢子/mL浓度有效，但需验证田间实际应用中孢子存活率。
- **抗性机制研究**：通过对比本地抗性种群与敏感品系的分子差异，解析毒素抗性突变位点。
- **多菌株协同施用**：基于酶活性互补性（如脂酶与磷脂酶组合），设计增效剂型以降低单剂使用量。

### 结论
本研究揭示了摩洛哥本土EPF菌株的生态适应性与高效作用机制，为苹果园生物防控提供了新策略。*Aspergillus*和*Penicillium*属真菌通过差异化作用路径（酶解协同/毒素主导）展现出互补优势，其中*P. olsonii*和*ASP1*菌株兼具遗传可塑性（代谢广谱性）与高效毒性（>75%死亡率），有望成为替代化学农药的可持续防控方案。基因分析进一步证实，毒素合成基因（*bauA*）和碳代谢基因（*ggps*）的共存是决定毒力的关键因素，为定向选育工程菌株提供了理论依据。