GSK3磷酸化激活海藻糖-6-磷酸合酶提升灵芝海藻糖产量与耐热性的机制研究

《Communications Biology》：GSK3 phosphorylates and activates trehalose-6-phosphate synthase to improve trehalose production and thermotolerance in Ganoderma lucidum

本研究揭示了灵芝中糖原合成酶激酶3通过磷酸化修饰海藻糖-6-磷酸合酶Ser529位点，显著增强其酶活性的新机制。研究人员发现GlGSK3-GlTPS信号模块在热应激条件下被特异性激活，通过促进海藻糖生物合成途径，有效改善灵芝菌丝体生长缺陷和耐热性下降问题。该发现为丝状真菌环境适应性调控提供了新的理论依据。

　　

在药用真菌研究领域，灵芝因其丰富的药理活性成分备受关注。然而在实际栽培过程中，高温胁迫往往导致菌丝体生长受抑、生物量下降，成为制约产业发展的关键瓶颈。以往研究表明，海藻糖作为重要的应激保护物质，在真菌应对高温环境中发挥着重要作用，但其生物合成的调控机制，特别是翻译后修饰层面的调控，仍存在大量未知。

发表于《Communications Biology》的最新研究首次揭示了糖原合成酶激酶3通过磷酸化海藻糖-6-磷酸合酶调控灵芝耐热性的分子通路。研究人员通过实验证实，GlGSK3能够直接与GlTPS相互作用，并在Ser529位点进行磷酸化修饰，这一修饰显著提升了GlTPS的酶活性。

关键技术方法包括：利用RNA干扰技术构建glgsk3-kd和gltps-kd基因敲低菌株；通过酵母双杂交筛选和免疫共沉淀验证蛋白相互作用；采用体外磷酸化实验和质谱分析鉴定磷酸化位点；使用高效液相色谱检测海藻糖含量；应用Western blotting分析蛋白表达和磷酸化水平。

GlGSK3敲低损害菌丝生长和子实体形成

系统发育分析显示GlGSK3含有保守的Ser/Thr激酶催化结构域。基因敲低菌株出现糖原积累增加、丙酮酸和ATP水平下降的表现，菌丝径向生长仅达野生型的62%-70%，且完全丧失子实体形成能力。

GlGSK3与GlTPS相互作用

酵母双杂交筛选发现GlGSK3与GlTPS存在直接相互作用，这一结果通过双分子荧光互补和GST pull-down实验得到进一步验证。免疫共沉淀显示内源性GlGSK3与GlTPS在灵芝菌丝体中形成稳定复合物。

GlGSK3磷酸化GlTPS的S529位点增强其酶活性

体外磷酸化实验证实GlGSK3可直接磷酸化GlTPS。质谱分析鉴定出Ser529为唯一磷酸化位点，该位点符合GSK3保守磷酸化 motif。磷酸模拟突变体GlTPS529D酶活性提升至野生型的1.30倍，而磷酸化缺陷突变体GlTPS529A活性降至62%。

GlTPS敲低损害海藻糖生产和菌丝生长

gltps-kd菌株菌丝生长量下降48%-53%，TPS酶活性和海藻糖含量显著降低。glgsk3-kd菌株也表现出类似的表型，证实二者参与同一调控通路。

GSK3-TPS模块有助于热应激抵抗

热应激上调GlGSK3和GlTPS表达水平，并增强GlTPS磷酸化。敲低菌株中热诱导的海藻糖积累显著受损，菌丝生长抑制更为明显。外源海藻糖处理可部分恢复耐热性，且在敲低菌株中效果更显著。

研究结论表明，GlGSK3通过双重机制平衡灵芝生长与应激响应：正常条件下通过磷酸化糖原合成酶促进糖酵解流，支持菌丝发育；热应激时转向磷酸化激活GlTPS，重定向碳流向海藻糖合成。该发现不仅阐明了GSK3在担子菌中的新功能，还为改善药用真菌抗逆性提供了理论依据。