FOXO4转录激活域通过双DXXD基序识别CBP-KIX结构域的两个疏水口袋：揭示协同转录调控新机制

《Communications Biology》：Recognition of two hydrophobic pockets in the KIX domain of CBP by FOXO4 transactivation domain

本研究针对FOXO4与共激活因子CBP结合机制不清的问题，通过多学科技术揭示了FOXO4-CR3通过独特的双DXXD基序同时结合CBP-KIX结构域的c-Myb和MLL位点。研究发现FOXO4-CR3对MLL位点具有优先结合特性，结合后形成α螺旋结构，其结合亲和力比同源蛋白FOXO3a高70倍。该研究为理解转录因子通过内在无序区域实现选择性混杂结合的分子机制提供了新视角，对阐明细胞衰老和癌变调控机制具有重要意义。

　　

在真核生物的基因转录调控网络中，cAMP反应元件结合蛋白(CREB)结合蛋白(CBP)作为关键共激活因子，通过其KIX结构域桥接转录装置与DNA结合转录因子。KIX结构域含有两个独立的疏水表面——c-Myb位点和MLL位点，能够同时结合不同转录因子的转录激活域。叉头框蛋白O亚族(FOXO)转录因子在细胞增殖、分化、应激抵抗等生命过程中发挥核心作用，其保守区域3(CR3)作为转录激活域，负责招募CBP等共激活因子。

尽管已知FOXO3a-CR3通过单个XXΦ基序与CBP-KIX结合，但FOXO4与CBP的结合亲和力显著高于FOXO3a，这一现象无法用单一保守基序解释。研究人员发现FOXO4-CR3中存在第二个DXXD基序，可能为CBP-KIX提供额外的结合位点。为了阐明FOXO4与CBP相互作用的独特机制，韩国光州科学技术院的Jeongbeen Heo等研究人员在《Communications Biology》上发表了最新研究成果。

研究团队综合运用等温滴定量热法(ITC)、核磁共振化学位移扰动(CSP)分析、圆二色谱(CD)和顺磁弛豫增强(PRE)等多种生物物理技术，结合分子对接模拟，系统研究了FOXO4-CR3与CBP-KIX的相互作用机制。

FOXO4-CR3与CBP-KIX两个疏水表面的差异性相互作用

通过¹H-¹⁵N HSQC滴定实验，研究人员发现FOXO4-CR3同时扰动CBP-KIX的c-Myb和MLL位点残基。对KIX进行位点特异性突变(MLL位点的I660A/L664A和c-Myb位点的Y650A/A654Q/Y658A)后，CSP分析显示MLL位点突变显著降低整体结合扰动，而c-Myb位点突变则增强MLL位点的结合信号，表明两个结合位点间存在变构通讯。

FOXO4-CR3主要通过第二个ΦXXΦΦ基序结合CBP-KIX

序列比对显示FOXO4-CR3含有两个连续的XXΦΦ基序：MDNII(第一基序)和ISDLM(第二基序)。NMR滴定实验表明，第二基序中的I487、S488和M491残基在结合时发生显著化学位移扰动，提示该区域是主要结合界面。当c-Myb位点突变时，结合模式发生改变，影响区域扩展至第一基序和多个酸性残基。

KIX两个疏水位点由不同热力学驱动

ITC实验揭示了两个结合位点的热力学差异：MLL位点结合主要由熵驱动(ΔS = 42.30±9.20 J/mol·K)，而c-Myb位点结合主要由焓驱动(ΔH = -5.98±0.75 kJ/mol)。MLLmut和c-Mybmut的K_d值分别为2.76±0.58μM和1.20±0.50μM，表明两个位点对结合亲和力均有贡献。

CR3与KIX MLL位点结合时诱导部分α螺旋形成

CD光谱显示FOXO4-CR3作为内在无序区域，在与KIX结合后螺旋度显著增加。与c-Mybmut结合时螺旋度增益达18%，对应约2.5圈α螺旋。Ca化学位移指数进一步证实结合诱导的螺旋化主要发生在两个XXΦΦ基序区域(FOXO4^483-491)。

CR3在KIX MLL位点可能采用非受限取向

PRE实验显示，无论自旋标记位于KIX的N端(C585)还是C端(S670C)，CR3的C端区域和XXΦΦ基序均受影响，表明结合取向不完全受限。AlphaFold3模拟预测CR3以两种主要取向结合MLL位点，但XXΦΦ基序的空间位置在大多数模型中保持一致，与KIX的L628等关键残基形成紧密疏水相互作用。

研究结论与意义

本研究通过多维度实验证实FOXO4-CR通过独特的双DXXD基序与CBP-KIX的两个疏水位点相互作用，其中对MLL位点表现出优先结合特性。与FOXO3a相比，FOXO4-CR3与KIX的结合亲和力高出70倍，这主要归因于第二个XXΦΦ基序的存在和结合后诱导的螺旋结构形成。

研究揭示了转录因子通过内在无序区域实现"选择性混杂结合"的分子机制：FOXO4-CR3在保持结合混杂性的同时，通过序列细微差异实现对特定结合位点的偏好性。这种机制可能对理解细胞衰老和癌变过程中FOXO4功能失调的分子基础具有重要意义。此外，研究为开发靶向CBP-KIX相互作用的治疗策略提供了结构基础，对干预衰老相关疾病和癌症具有潜在应用价值。