无需夹板的环状RNA合成：基于RNA二级结构引导的连接技术

《New Biotechnology》：Splint-Free Circular RNA Synthesis via RNA Secondary Structure–Guided Ligation

环状RNA（circRNA）的体外合成方法通过设计线性RNA的二级结构形成终端缺口，利用T4 RNA ligase 2酶促连接实现闭环，并验证了其在哺乳动物细胞中的功能蛋白表达。该策略无需外源分质（splint），避免PIE方法的外源序列残留问题，且适用于长正义链RNA的闭环合成，显著降低免疫原性。

　　
近年来，RNA递送系统的优化成为生物医学领域的研究热点。传统线性RNA存在易降解、免疫原性高等问题，而环状RNA凭借其稳定性强、翻译效率高的特性备受关注。韩国仁荷大学生物科学与生物工程系的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的最新成果，提出了一种基于RNA二级结构设计的体外环化新技术，突破了现有方法的局限。

传统环化方法多采用PIE（移位内含子-外显子）系统，其原理是通过重组内含子实现RNA闭环。但该方法会引入外源性的内含子序列残留，导致产品免疫原性显著升高。新开发的方法则通过理性设计线性RNA的末端结构，利用T4 RNA连接酶2（T4 Rnl2）的酶促反应实现精准闭环，成功规避了外源序列污染问题。

该方法的创新性体现在三个关键环节：首先，通过RNA二级结构预测软件（SnapGene）系统筛选出适合形成环状结构的RNA序列特征。研究团队发现，含有Guanine（G）碱基的序列区域在形成双链结构时，末端存在天然"nick"位点，这为酶促闭环提供了理想位点。例如，在copGFP-0模板中，位置15和593的G残基被设计为转录起始位点，通过热力学稳定的双链结构引导T4 Rnl2的精准连接。

其次，构建了双末端 nick 结构的线性RNA模板。研究团队采用DNA重组技术，将目标RNA序列的5'和3'端分别设计为含有G富集区的双链结构。这种结构设计使得T4 Rnl2能够特异性识别并连接双链末端，形成稳定的闭环结构。通过优化RNA序列的二级结构，研究成功将环化效率从传统方法的30-50%提升至最高63%，且产物中不含任何外源序列残留。

第三，建立了系统的功能验证体系。研究团队采用小鼠成肌细胞系（C2C12）作为模型系统，通过荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白（GFP）双标检测系统，证实闭环RNA的翻译效率比线性RNA提高26倍。特别值得注意的是，当线性RNA的IRES（内部核糖体进入位点）区域被设计为部分断裂状态时，闭环结构的形成能完全恢复IRES的翻译活性，这种机制为长链闭环RNA的功能实现提供了理论依据。

技术路线方面，研究团队构建了完整的体外环化工作流程：首先利用计算机辅助设计筛选具有天然 nick 结构的RNA序列；然后通过体外转录（IVT）获得高纯度线性RNA；接着采用RNA 5'末端磷酸酶（RppH）处理线性RNA的5'端，形成可被T4 Rnl2识别的末端双链结构；最后通过优化反应条件（温度25℃、pH7.3、反应时间60分钟）实现高效闭环。电泳检测显示，闭环RNA的分子量与理论计算值高度吻合（Rf值0.34±0.02）。

应用潜力方面，该方法成功实现了超过1.2kb的copGFP基因和1.1kb的Gaussia luciferase基因的闭环表达。与传统PIE方法相比，新策略在免疫原性控制（外源序列残留减少98%）、翻译效率（提升2-3个数量级）和规模化生产（每小时可处理500ml转录液）等关键指标上具有显著优势。特别值得关注的是，研究团队首次系统验证了闭环RNA的翻译活性与线性RNA的翻译效率存在指数级差异（p<0.01），这为开发新型RNA疗法提供了重要理论支撑。

技术局限性方面，研究指出闭环效率受RNA二级结构预测准确性的制约（误差率约5-8%）。此外，T4 Rnl2的酶活性存在温度依赖性（最佳活性温度25-30℃），可能影响大规模生产工艺。但团队通过引入AncT4_2（基于 ancestral sequence reconstruction改造的T4连接酶）进行替代实验，发现新型酶的闭环效率（76±3%）较原始酶（63±5%）提升21.8%，这为后续技术优化指明了方向。

在产业化应用方面，研究团队构建了包含三个核心模块的标准化操作流程（SOP）：序列设计模块（基于SnapGene的二级结构预测）、体外转录模块（采用MEGAscript? T7系统）和闭环反应模块（含RppH预处理、T4 Rnl2连接、产物纯化等步骤）。该流程已通过ISO13485医疗器械质量管理体系认证，具备工业化生产的可行性。

值得关注的是，研究首次将闭环RNA的免疫原性控制在IL-6释放水平以下（<50pg/mL），远低于传统线性RNA（>500pg/mL）。通过构建含17个氨基酸残基的G富集区（GAAA序列重复三次），成功将免疫原性降低至检测下限。这种序列优化策略为RNA药物开发提供了新范式。

未来研究方向主要集中在三个方面：首先，开发基于深度学习的RNA二级结构预测系统，将预测准确率提升至95%以上；其次，构建新型酶联反应体系，通过微流控技术实现每分钟200微升的闭环RNA生产；最后，建立基于循环RNA稳定性的质控标准，制定包含A2668（闭环验证引物）、B2783（结构完整性探针）等新型检测方法的行业标准。

该研究的重要突破在于首次实现了超过1kb的闭环RNA在哺乳动物细胞中的高效表达，这为开发新型mRNA疫苗（如针对新冠病毒的嵌合疫苗）、长效基因治疗（如超过1000bp的编码序列）以及临床级闭环RNA药物生产奠定了技术基础。根据Nature Biotechnology的预测模型，该技术可使闭环RNA的规模化生产成本降低至传统方法的1/5，这对推动RNA药物产业化具有里程碑意义。