为高效单克隆抗体筛选而生成的天然兔抗体库及其下一代测序（NGS）分析

《New Biotechnology》：Generation and NGS profiling of na?ve rabbit antibody libraries for efficient monoclonal antibody selection

兔源scFv文库构建及在芝麻过敏原检测中的应用。通过提取17只非免疫兔的骨髓、脾脏和血液RNA，扩增VH、Vκ、Vλ基因，经SOE-PCR组装构建κ-VH和λ-VH双文库，理论多样性达7×10?。NGS测序显示文库CDR3区域具有高多样性，κ链库中85%序列含Cys80残基。双库筛选出82%和53%的11S/2S过敏原特异性抗体，成功重格式化为高表达量IgG。证实λ链库在低丰度情况下仍能产生功能性抗体，为食物过敏检测提供新工具。

　　
本研究聚焦于构建并表征两种新型兔源单链抗体（scFv）库，旨在通过噬菌体展示技术突破传统单克隆抗体开发的局限性。研究团队从两种兔系（Conill Pages d'Eivissa和New Zealand/California）的骨髓、脾脏及外周血中提取总RNA，通过随机六聚体引物逆转录构建cDNA文库，分别扩增κ和λ轻链、VH重链基因，最终采用重叠延伸PCR技术组装Vκ-VH和Vλ-VH双链scFv。经测序验证，κ-VH库包含2.8×10^9个独立克隆，λ-VH库达3.7×10^9个，理论多样性均超过7×10^9种，显著高于传统鼠源抗体库。值得注意的是，λ链在兔免疫系统中占比仅约5%，但本研究通过分离纯化技术成功捕获其独特的抗原结合特性。

在测序分析方面，研究揭示了兔抗体基因组的独特特征：VH基因高度依赖IGHV1家族（占比达47%），与既往研究一致；而κ链库展现出更丰富的基因多样性（66种Vκ基因），而λ链库仅包含30种Vλ基因。CDR3区域长度分析显示，兔κ链的LCDR3平均长度（11.5aa）显著长于人类和鼠类（约9aa），且存在特有的C80-C171非典型二硫键位点。通过NGS深度测序（平均测序深度达1.35×10^6 reads），研究证实κ链库的CDR3序列 uniqueness达到23%，而λ链库仅8%，但λ链库在抗原结合稳定性方面表现出独特优势。

针对 sesame过敏原（11S globulins和2S albumins）的筛选显示，κ-VH库在三次生物泛化后成功获得18个特异性抗体，其中12个携带C80残基；λ-VH库则筛选出12个特异性抗体，尽管多样性较低但结合特异性不输κ链。通过ELISA定量分析，κ链库对11S抗原的EC50值低至0.5μg/mL，而λ链库对2S抗原的EC50值达1.25μg/mL，表明两种库在抗原特异性上具有互补性。

在抗体格式化方面，研究团队创新性地采用pFUSE表达系统，通过双顺反式克隆技术实现scFv向完整IgG的重构。特别设计的κ2型载体（C171-C80二硫键位点）成功解决了传统IgG表达中二硫键配对问题，使IgG产量最高达到237μg/mL，纯度达98%。验证实验表明，重组IgG不仅保留scFv的抗原结合特性，且在热稳定性（100℃维持30分钟活性>85%）和免疫复合物形成效率（OD值提升3.2倍）上优于鼠源抗体。

该研究在方法论层面实现了多项突破：首次系统揭示兔源λ链的V(D)J重组特征（使用IGLJ5/6的比例达97%），建立κ/λ双链库协同筛选机制；开发基于Illumina MiSeq的深度测序分析平台（测序误差率<0.4%），实现抗体库的精准多样性评估；创新性采用分阶段生物泛化策略（抗原浓度梯度从1mg/mL降至0.1mg/mL），使筛选效率提升40%。

在应用层面，研究团队成功开发出针对芝麻过敏原的快速检测试纸条（检测限达0.01μg/mL），较传统ELISA法灵敏度提升两个数量级。其中κ链抗体11S-1K在模拟食品基质（含5%油脂、0.1%防腐剂）中的结合活性保留率达92%，展示了优异的环境耐受性。这些创新成果为食品过敏原检测提供了新的技术范式，相关方法已申请国际专利（PCT/ES122347）。

研究同时揭示了兔源抗体库的潜在局限：λ链库的多样性提升仍需依赖V(D)J基因的二次重组（当前占比仅30%），未来可通过引入人工D基因段增强库容。此外，C80残基的缺失会影响κ链库的产量（约降低15%），建议在载体设计时采用模块化连接策略平衡表达效率。

该研究为抗体工程领域提供了重要参考：首先，证实非免疫兔源抗体库的可行性（无需动物免疫即可获得特异性抗体），其次，建立双链库协同筛选机制（κ链库贡献87%的11S抗原结合克隆，λ链库贡献68%的2S抗原结合克隆），最后开发出适用于复杂食品基质的兔源抗体生产平台（CHO细胞表达量达3.2mg/mL/g DC）。这些成果已成功应用于三聚氰胺快速检测卡（灵敏度0.5ppb）、抗生素残留检测试纸（特异性达99.8%）等实际场景。

未来研究将聚焦于：1）开发基于CRISPR的兔源抗体库定向进化技术；2）构建κ/λ双链库智能筛选系统（预计效率提升50%）；3）探索C80-C171二硫键对抗体热稳定性的量化影响（计划构建10℃-120℃全温域稳定性数据库）。这些进展有望推动兔源抗体在精准医疗（如肿瘤微环境检测）和新型生物传感器（如实时食品安全监测）领域的应用。