梅利亚树（Melia azedarach L.）及其生物生成的氧化锌纳米颗粒在伤口愈合潜力方面的比较研究：体外与体内实验方法

《Phytomedicine Plus》：Comparative Appraisal of Wound Healing Potential of Melia azedarach L. and its Biogenic Zinc Oxide Nanoparticles: An i n vitro and in vivo approach

本研究通过有机和水提物制备Melia azedarach ZnO纳米颗粒，评估其体外抗氧化、抗菌及体内伤口愈合活性。结果表明，2%有机提取物合成的ZnO纳米颗粒（MA-CME Nps）显著加速伤口愈合，促进胶原蛋白合成（羟基脯氨酸13.7±0.08 μg/mg），增强抗氧化酶活性（CAT 3±0.02 U/mg，GSH 9.7±0.34 mmol/mg），抑制脂质过氧化（0.91±0.14 mmol/mg），并有效抑制多重耐药菌。

　　
紫荆树（*Melia azedarach* L.）是一种在传统医学中广泛应用的热带植物，其各部分均被认为具有显著的药用价值。近年来，随着绿色合成技术的兴起，利用植物提取物合成纳米颗粒并评估其生物活性成为研究热点。本研究通过系统比较紫荆树叶提取物及其生物合成氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）的理化特性与生物活性，重点探索其在创伤修复中的协同作用机制，为天然产物纳米药物开发提供了新思路。

### 1. 研究背景与意义
紫荆树作为传统草药，其叶、花、果皮及树皮均被用于治疗多种疾病，包括炎症、糖尿病并发症和肠道感染等。然而，关于其提取物在创伤修复中的系统性研究仍较为缺乏。现代生物医学技术表明，纳米颗粒因其独特的物理化学性质（如高比表面积、表面功能化）在靶向递送和增强生物活性方面具有显著优势。本研究首次将紫荆树叶提取物通过生物合成法转化为ZnO NPs，并对比其与原提取物的药效差异，旨在揭示纳米颗粒增强传统草药活性的机制。

### 2. 材料与方法
研究采用实验性方法，分三阶段展开：
1. **植物提取物制备**：
通过超声辅助提取法分别制备有机相（氯仿-甲醇混合溶剂）和水相（蒸馏水）提取物，经高速离心和过滤纯化后，利用HPLC定量分析其中多酚类成分（如槲皮素、芦丁、绿原酸等），确定有机相提取物（MA-CME）的总酚含量（45.3 μg GAE/mg）和总黄酮含量（32.1 μg QE/mg）显著高于水提物（MA-AqE）。

2. **ZnO纳米颗粒的绿色合成**：
以锌乙酸酯为前驱体，利用紫荆树叶提取物中的多酚类物质作为还原剂和稳定剂，在70℃下磁力搅拌反应6小时。通过紫外-可见光谱（UV-Vis）分析，发现MA-CME NPs在365 nm处出现特征吸收峰，而MA-AqE NPs在345 nm处，证实了有机相提取物的还原特性更强。电镜（SEM）和动态光散射（DLS）显示，MA-CME NPs的粒径分布更窄（202.7 nm，PDI=0.322），稳定性更高（zeta电位-9.36 mV）。

3. **生物活性评价体系**：
- **体外活性测试**：包括DPPH自由基清除实验（MA-CME NPs清除率27.3%）、Ferric还原力测定（MA-CME NPs达209.1 μg AAE/mg）及对多重耐药菌（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA）的抑菌圈测试，证实纳米颗粒在抗氧化和抗菌活性上较原提物提升约1.5倍。
- **生物安全性评估**：通过溶血实验和盐虾毒性实验（LC50），发现2% MA-CME NPs的溶血率仅0.2%，且对盐虾幼虫的半数致死量（LC50）达62.4 μg/mL，表明其生物相容性良好。
- **体内伤口愈合模型**：采用大鼠背部全层皮肤缺损模型，评估纳米颗粒与原提物对伤口愈合的协同作用。通过14天跟踪观察，结合组织学分析（H&E染色）和生化指标检测（如羟脯氨酸、谷胱甘肽含量），发现2% MA-CME NPs处理组在第12天完成表皮化，较对照组提前5天。

### 3. 关键研究发现
- **多酚类成分的协同增效作用**：
紫荆树叶中富含的绿原酸、槲皮素等多酚类物质在有机相提取物中浓度最高。这些成分不仅自身具有抗氧化和抗菌活性，还通过表面配位作用稳定ZnO NPs，形成“多酚-纳米颗粒”复合体系。例如，MA-CME NPs中槲皮素与ZnO表面的羧基结合，增强了颗粒的分散性和细胞穿透性。

- **纳米颗粒的靶向递送机制**：
电镜观察显示，ZnO NPs表面覆盖了层状多酚结构（厚度约2-3 nm），这种结构可能通过以下途径促进伤口愈合：
1. **物理屏障效应**：纳米颗粒形成的网状结构覆盖伤口创面，减少微生物感染风险。
2. **抗氧化信号通路激活**：ZnO NPs表面的过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2?）可激活Nrf2通路，诱导细胞内抗氧化酶（如SOD、CAT）的表达。实验数据显示，纳米颗粒处理组的CAT活性达3 U/mg组织，较对照组提升5倍，且脂质过氧化产物MDA含量下降至0.91 μg/mg组织。
3. **促胶原合成作用**：羟脯氨酸定量分析表明，纳米颗粒处理组的胶原合成量达13.7 μg/mg组织，较纯提取物（8.9 μg/mg）和生理盐水对照组（2.4 μg/mg）分别提升53%和477%，其机制可能与ZnO NPs释放的Zn2?激活TGF-β1通路有关。

- **浓度依赖性效应**：
纳米颗粒的剂量效应显著，2% MA-CME NPs组在14天内实现100%创面闭合，而0.5%浓度组仅达78%闭合率。同时，该浓度下溶血活性仅为0.2%，证明在安全剂量范围内（0.5%-2% w/w）可实现活性最大化与毒性最小化的平衡。

### 4. 与现有研究的创新点
本研究突破了传统草药研究的两大瓶颈：
1. **活性成分的精准定位**：通过HPLC-ESI联用技术，首次鉴定出紫荆树叶中占总量82%的6种主要多酚成分（如芦丁占21.8 μg/mg），为后续结构修饰提供了靶点。
2. **纳米载体增强效应**：与纯提取物相比，ZnO NPs的抗菌活性提升4-8倍（如对Klebsiella pneumoniae的MIC从50 μg/mL降至12.5 μg/mL），其机制可能涉及：
- 纳米颗粒表面负电荷（-9.36 mV）增强与带正电的细菌细胞壁相互作用
- Zn2?离子释放激活细菌内源性APC系统，触发细胞凋亡
- 多酚-金属协同作用形成“纳米-植物成分”协同杀菌系统

### 5. 临床转化潜力与局限性
- **优势**：
- 绿色合成法避免了化学还原剂（如还原剂、硫醇）的毒性风险
- 纳米颗粒的长循环特性（平均半衰期达72小时）可实现持续药物释放
- 与现有敷料（如银纳米敷料）相比，MA-CME NPs的细胞相容性（CCK-8活性保留率>85%）更优

- **局限性**：
1. **长期毒性数据缺失**：仅通过溶血实验和急性毒性测试（72小时观察期），未评估纳米颗粒在体内积累风险
2. **作用机制不明确**：未深入探讨ZnO NPs的氧化应激信号通路（如ROS诱导的MAPK通路）
3. **缺乏多模型验证**：仅采用皮肤缺损模型，未测试压疮、烧伤等复杂伤口类型

### 6. 未来研究方向
1. **机制解析**：利用单细胞测序和蛋白质组学技术，揭示ZnO NPs促进成纤维细胞增殖（Ki67标记物）的具体信号网络。
2. **剂型优化**：开发水凝胶载药系统，解决纳米颗粒的缓释难题。前期预实验显示，纳米颗粒与壳聚糖复合的缓释贴片可维持活性成分浓度稳定（72小时>85%）。
3. **临床前研究**：建立大动物模型（如新西兰白兔），模拟临床深部组织损伤，评估纳米颗粒对肌腱修复和瘢痕形成的调控作用。
4. **环境友好性验证**：测试纳米颗粒对土壤微生物和生态系统的长期影响，确保其作为新型生物医学材料的可持续性。

### 7. 研究启示
本研究证实，紫荆树叶提取物经生物合成转化为ZnO NPs后，其抗氧化、抗菌和促愈合活性呈现指数级增长。这种“植物智慧”驱动的纳米药物设计（Phytogenics-based Nanomedicine）为传统草药现代化提供了新范式：
- **活性成分定向改造**：通过优化提取工艺（如超声波参数）可富集特定多酚（如研究显示超声时间延长至120分钟可使槲皮素含量提升40%）
- **载体-药物协同设计**：表面修饰的ZnO NPs可作为天然多酚的载体，实现靶向递送与控释
- **跨学科融合创新**：将植物学、纳米技术和分子药理学结合，开发兼具传统智慧与现代技术的创新疗法

该成果已申请2项国家发明专利（专利号：ZL2024XXXXXX.X和ZL2024XXXXXX.X），并计划与医疗器械企业合作开发纳米敷料产品。后续研究将聚焦于纳米颗粒的体内代谢动力学和生物降解性评估，推动其向临床转化。