来自沙门氏菌 pullorum 噬菌体的 holins 的生物功能鉴定及其对鸡 pullorum 疾病的治疗效果

《Poultry Science》：Biological Functional Identification of Holins from Salmonella Pullorum Phages and Their Therapeutic Efficacy Against Pullorum Disease in Chickens

噬菌体裂解蛋白Holin-P和Holin-1协同抑制鸡肠道沙门氏菌感染，乳酸乳球菌表达系统有效降低细菌载量及IL-6水平，为抗生素替代提供新策略。

　　
该研究聚焦于沙门氏菌pullorum（S.Pullorum）噬菌体vB_SpuM_23的基因组解析与裂解蛋白开发，旨在为禽类致病菌的替代疗法提供新思路。研究团队通过全基因组测序和系统发育分析，确认vB_SpuM_23与沙门氏菌SWJM-02和SalM SPJ41具有高度亲缘关系，基因组包含124个开放阅读框，总长85,227bp，GC含量47.51%，且未检测到溶原性相关基因，表明其属于纯裂解型噬菌体。值得注意的是，该噬菌体基因组中编码了两种关键裂解蛋白——Holin-P（型III膜蛋白）和Holin-1（型II膜蛋白），以及辅助裂解酶Endolysin和Lysis蛋白。

研究通过大肠杆菌和乳酸乳球菌表达系统成功构建了Holin-P、Holin-1及其复合体Holin-P-Holin-1。体外实验显示，这些蛋白在pH6和37℃条件下表现出最优裂解活性，且复合体的协同效应显著优于单一蛋白。宿主范围实验表明，裂解蛋白不仅对S Pullorum有效，还能裂解E Coli、S Typhimurium等常见食源性致病菌，特别对S Enteritidis表现出广谱裂解能力，这与其直接作用于细菌内膜而非依赖噬菌体吸附机制有关。

在鸡感染模型中，口服递送重组乳酸乳球菌表达的裂解蛋白组合，成功将肠道和肛门拭子中S Pullorum载量降低2-3个数量级，且显著抑制血清IL-6水平。病理学分析显示，联合治疗组的肝脏和肠道组织炎症反应较对照组减少60%-70%，肠道绒毛结构完整性得到保留。研究首次证实复合裂解蛋白的协同效应，其治疗效率较单一蛋白提升40%-50%，且未观察到明显肠道菌群失调或免疫抑制现象。

该研究突破了传统噬菌体疗法对特定宿主受体的依赖限制，开发出基于膜孔蛋白的广谱裂解技术。通过比较不同表达系统的优势，发现乳酸乳球菌不仅能够高效表达可溶裂解蛋白，其天然定植能力还能通过Usp45信号肽实现肠道靶向递送。这种口服递送系统避免了传统噬菌体疗法需注射或反复给药的局限性，为开发新型益生菌疗法奠定了基础。

在抗菌机制方面，研究揭示了Holin-P和Holin-1的协同作用：Holin-P作为型III膜孔蛋白首先形成跨膜孔道，Holin-1作为型II膜蛋白增强孔道稳定性，两者共同作用使内溶酶（Endolysin）和裂解酶（Lysis）更高效地降解肽聚糖层。这种级联激活机制解释了复合蛋白较单一蛋白提升2.8倍裂解效率的原因。

环境稳定性测试显示，Holin-P复合体在4℃下可稳定保存72小时活性，pH范围5-8内活性保持≥80%，且对高温（>50℃）和极端pH（<4或>10）具有较强耐受性。这些特性使其适合作为活菌制剂在禽类养殖环境中应用。此外，研究首次发现S Enteritidis虽对噬菌体不敏感，但对Holin-P-Holin-1复合体裂解酶敏感，这为开发广谱抗菌蛋白提供了新方向。

在安全性评估方面，重组乳酸乳球菌的表达系统展现出显著优势：1）产生的Holin蛋白免疫原性极低，未检测到抗体应答；2）乳糖发酵产生的乳酸可抑制致病菌增殖；3）通过Usp45分泌系统实现肠道靶向表达，减少全身分布。这些特性使其符合FDA对益生菌药物的安全标准。

该研究对动物源性致病菌防控具有双重价值：一方面，复合裂解蛋白作为新型抗菌剂可减少抗生素使用；另一方面，构建的重组乳酸乳球菌表达系统为开发其他肠道益生菌药物提供了技术范式。例如，已验证的Lactococcus lactis NZ3900载体可高效表达其他抗菌蛋白（如乳铁蛋白衍生肽），其表达产物对S Pullorum、C Perfringens等均表现出裂解活性。

未来研究可拓展至以下方向：1）优化蛋白表达条件以提升产量，目前E Coli系统蛋白产量约1.5mg/L，而Lactococcus可达3-5mg/L；2）探索复合蛋白与其他益生菌（如乳酸菌素）的协同效应；3）开发基于噬菌体裂解酶的饲料添加剂，通过调节肠道菌群抑制致病菌定植。这些方向将有助于实现从实验室研究到实际应用的转化，推动绿色兽药的发展。

值得注意的是，研究团队在实验设计中采取了多重验证策略：1）通过全基因组测序排除溶原性可能；2）构建E Coli和Lactococcus双表达系统验证蛋白功能；3）使用RT-qPCR和菌落计数双重方法评估肠道载量；4）结合血清学检测和病理学分析综合评估疗效。这种严谨的研究方法为后续临床应用提供了可靠数据支持。

在产业化应用层面，研究提出的三阶段开发路径具有可行性：第一阶段优化蛋白表达工艺，使Holin-P-Holin-1复合体产量达到5mg/L；第二阶段开发冻干粉制剂，确保常温下保存稳定性；第三阶段进行动物试验，评估对商品代鸡的预防效果（如攻毒试验中保护率需≥90%）。目前研究已处于第二阶段，成功开发出稳定表达Holin复合体的Lactococcus工程菌株。

该研究对禽类沙门氏菌病的防控具有重要实践意义。传统抗生素治疗存在耐药性（研究显示当地耐药菌株占比已达35%）和药物残留问题，而噬菌体疗法存在宿主特异性强（仅对S Pullorum有效）和需要低温运输的局限性。本研究开发的复合裂解蛋白展现出广谱抗菌活性（覆盖5种常见食源性致病菌），且通过乳酸乳球菌递送可同步发挥益生菌的益生元效应，这为开发新一代多功能兽药开辟了新途径。

在分子机制层面，研究揭示了Holin蛋白的膜整合特性：Holin-P含有一个跨膜域，负责形成稳定孔道；Holin-1则通过两个跨膜区维持孔道结构完整性。这种协同作用机制在之前的研究中尚未被报道，为理解噬菌体裂解蛋白的分子机制提供了新视角。特别值得注意的是，复合体在裂解过程中表现出时间依赖性，24小时后裂解效率达到峰值，这可能与膜孔道的动态稳定性有关。

从产业转化角度，研究提出的Lactococcus表达系统具有显著优势：1）符合GRAS食品添加剂标准；2）通过发酵工艺即可规模化生产；3）蛋白表达产物天然具有抗菌活性。目前全球已有3家生物科技公司采用类似技术路线开发益生菌药物，预计未来五年相关市场规模将增长至8亿美元。

最后，研究团队通过成本效益分析显示，采用Lactococcus表达系统的复合裂解蛋白成本（约$2.5/kg）仅为传统抗生素（$15/kg）的六分之一，且治疗周期可缩短至5天。这为禽类养殖企业提供了经济可行的替代方案，特别是在欧盟已禁止多粘菌素等抗生素作为饲料添加剂的背景下，具有特别重要的应用价值。