长期口服GCase激活剂可降低帕金森病LRRK2突变小鼠脑内可溶性α-突触核蛋白寡聚体积累

《npj Parkinson's Disease》：Long-term oral glucocerebrosidase activator reduces soluble α-synuclein oligomer accumulation in Parkinsonian LRRK2 mutant mouse brain

本研究针对帕金森病中LRRK2突变导致的GCase功能异常和α-突触核蛋白寡聚体积累这一关键病理环节，通过长期口服GCase激活剂ambroxol（ABX）干预 aged LRRK2R1441G突变小鼠模型。研究发现ABX可穿透血脑屏障，显著提升脑内GCase酶活性，改善溶酶体功能，并特异性降低纹状体内可溶性α-syn寡聚体水平至生理范围，而不影响总α-syn及pSer129水平。该研究首次证实长期GCase激活治疗可逆转遗传性帕金森病相关α-syn病理积累，为疾病修饰治疗提供新策略。

　　

在帕金森病（Parkinson's disease, PD）复杂而神秘的发病机制中，两个关键"角色"日益受到科学家的关注：一个是位于细胞内的"清洁工"——葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase, GCase），另一个则是错误折叠后"捣乱"的α-突触核蛋白（alpha-synuclein, α-syn）。正常情况下，GCase负责分解细胞内的葡萄糖脑苷脂（glucocerebroside, GlcCer），而α-syn则参与神经递质的释放调节。然而，在帕金森病患者的大脑中，GCase功能下降，α-syn异常磷酸化并聚集形成有毒的可溶性寡聚体，最终导致多巴胺能神经元逐渐死亡。

更为复杂的是，约5-10%的帕金森病患者携带GCase编码基因GBA1的突变，使得这种酶的功能先天不足。与此同时，富含亮氨酸重复激酶2（leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2）基因突变也是帕金森病常见的遗传风险因素，尤其值得关注的是，LRRK2突变会通过影响Rab10蛋白导致GCase活性降低，从而加剧α-syn的异常聚集。然而，药物激活GCase是否能改善LRRK2相关帕金森病的病理变化，尤其是减少α-syn寡聚体的积累，仍是一个未解之谜。

在这项发表于《npj Parkinson's Disease》的研究中，由香港理工大学Philip Wing-Lok Ho教授领导的研究团队，利用具有帕金森病病理特征的LRRK2^R1441G突变小鼠模型，探索了长期口服GCase激活剂ambroxol（ABX）对脑内α-syn寡聚体积累的治疗潜力。

研究团队运用了多种关键技术方法：在细胞水平，采用人源SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）模型，通过Western blotting检测蛋白质表达，4-MU荧光法测定GCase酶活性；建立实时流式细胞术检测溶酶体蛋白酶活性的方法（DQ-BSA assay）；在动物实验中，使用14月龄的LRRK2^R1441G纯合敲入小鼠模型，通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定组织中药代动力学，采用18周的自发性喂食给药方案（平均剂量45.9 mg/kg/天），并通过特异性ELISA方法定量脑组织中的α-syn寡聚体水平。

Treatment of GCase activator(ABX) increased cellular GCase activity and reduced level of Ser129-a-syn phosphorylation without affecting total aSyn expression

研究人员首先在细胞水平验证了ABX的药理作用。在稳定过表达人源α-syn的SH-SY5Y细胞中，50μM ABX处理72小时后，细胞GCase活性显著提升（正常细胞增加24.2%，α-syn过表达细胞增加16.9%），且呈现剂量依赖性。Western blot结果显示，ABX处理后GCase的蛋白编码基因GBA的表达水平也相应增加，但总α-syn水平不变。重要的是，ABX显著降低了磷酸化Ser129-α-syn（pSer129）的水平（降低16.9%），这表明ABX可能通过激活GCase影响了α-syn的病理修饰过程。

ABX rescued GCase deficiency and suppressed Ser129-a-syn phosphorylation in LRRK2R1441G mutant mouse embryonic fibroblasts(MEFs)

为了在更接近疾病背景的模型中验证ABX效果，研究团队使用了LRRK2^R1441G突变小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。研究发现，突变型MEFs的基础GCase活性比野生型低40.4%，证实了LRRK2突变导致GCase功能缺陷。用50μM ABX处理24小时后，突变细胞的GCase活性恢复了21.6%。有趣的是，当用溶酶体抑制剂bafilomycin A1（Baf-A1）人为制造溶酶体压力时，野生型细胞能通过上调GCase活性来应对压力（200nM Baf-A1处理后活性增加120.3%），而突变细胞则丧失了这种代偿能力。ABX处理同样能在突变MEFs中显著降低pSer129-α-syn水平（降低84.33%），且这一效果在ABX经过80°C热处理30分钟后依然保持，证明ABX具有良好热稳定性，适合掺入饲料进行长期动物实验。

Impaired lysosomal degradation in LRRK2R1441G mutant MEFs was attenuated by ABX treatment

α-syn寡聚体主要在溶酶体中降解，研究团队进而评估了ABX对溶酶体功能的影响。通过DQ-BSA实时降解实验发现，LRRK2突变型MEFs的溶酶体蛋白酶活性比野生型低57.9%，而ABX处理能显著改善这一缺陷，使突变细胞的溶酶体活性提升30.4%。这表明ABX不仅激活GCase，还能整体改善溶酶体功能，这可能有助于促进α-syn寡聚体的清除。

Brain penetration of ABX and drug clearance

在动物实验前，研究人员首先评估了ABX在小鼠体内的药代动力学特征。单次口服400 mg/kg ABX后，药物在4小时达到脑内峰值浓度（199.78±117μg/g组织），48小时后完全代谢。更关键的是，14天自发喂食含ABX饲料后，在14月龄的LRRK2突变小鼠脑内检测到的ABX浓度（28.08±5.9μg/g）显著高于野生型小鼠（12.3±2.2μg/g），表明突变小鼠血脑屏障对ABX的通透性可能更高，这为后续治疗研究提供了药代动力学基础。

Long-term(18-week) spontaneous feeding of ABX reduced cumulative food consumption without significant changes in average body weight

为避免长期灌胃对小鼠造成应激，研究团队创新性地将ABX混入标准饲料中进行长达18周的治疗。结果显示，ABX治疗组小鼠体重保持稳定，但累积食物消耗量减少，尤其是在LRRK2突变小鼠中更为明显。计算得出小鼠平均每日ABX摄入量为45.9 mg/kg/天，远低于小鼠口服半数致死剂量（2380 mg/kg），证明该给药方案安全可行。

Long-term spontaneous feeding of ABX increased GCase activity in striatum without affecting GBA protein levels

18周治疗后，研究人员检测了小鼠纹状体（帕金森病最易受累的脑区）的GCase活性。发现LRRK2突变小鼠的基础GCase活性比野生型低13.1%，而ABX治疗使野生型和突变型小鼠的纹状体GCase活性分别提升21.6%和40.6%。值得注意的是，GCase的蛋白水平在治疗前后无显著变化，证实ABX是通过变构激活而非增加蛋白表达来增强GCase功能。

Long-term spontaneous feeding of ABX did not affect Ser129-a-syn phosphorylation levels in striatum

与细胞实验结果不同，18周ABX治疗并未改变小鼠纹状体中pSer129-α-syn的水平。总α-syn水平同样无显著变化。这表明在体情况下，ABX对α-syn病理的改善可能不依赖于调节其磷酸化状态。

Long term spontaneous feeding of ABX reduced soluble a-syn oligomer levels in mutant LRRK2 R1441G mouse striatum

最关键的发现在于，通过特异性ELISA检测，研究发现LRRK2突变小鼠纹状体和皮层中的可溶性α-syn寡聚体水平显著高于野生型小鼠（纹状体增加79.7%，皮层增加20.6%）。而18周ABX治疗后，突变小鼠纹状体的α-syn寡聚体水平显著降低了23.4%，恢复到与野生型小鼠相当的生理水平。值得注意的是，这种改善作用具有脑区特异性，仅在纹状体观察到，皮层中无显著变化。

研究结论与讨论部分强调，这是首次在体证明长期GCase激活治疗可减少帕金森病易感脑区中的α-syn寡聚体积累。研究表明，ABX通过变构激活GCase，增强溶酶体功能，促进α-syn寡聚体的清除，而不是通过调节pSer129-α-syn来抑制寡聚体形成。这种作用可能与ABX降低葡萄糖脑苷脂（GlcCer）水平有关，因为GlcCer已知可稳定α-syn寡聚体。

该研究的临床意义在于，为LRRK2相关帕金森病的治疗提供了新的策略。目前，多项针对GCase的临床试验正在进行中，包括ABX的三期临床试验（ASPro-PD，NCT05778617）和Vanqua Bio公司的VQ-101一期临床试验。这些试验主要针对GBA1突变帕金森病患者，而本研究首次在LRRK2突变背景下证实了GCase激活剂的治疗潜力。

研究还提出未来可探索GCase激活剂与LRRK2抑制剂联合治疗的可能性，通过同时靶向LRRK2激酶活性和GCase功能，可能更有效地延缓帕金森病的进展。此外，研究建立的长期自发喂食给药方案为临床前药效评价提供了可行且动物福利友好的方法。

总之，这项研究深化了我们对GCase功能与α-syn病理之间关系的理解，为开发针对帕金森病核心病理环节的疾病修饰疗法提供了重要实验依据，尤其为LRRK2突变携带者的早期干预提供了新思路。