CFTR密码子偏好通过调控翻译速率平衡错误折叠聚集与通道功能的构象印记机制

《Scientific Reports》：Native CFTR codon bias controls translation rate to balance off-pathway aggregation and channel function by conformational imprinting

本研究针对CFTR蛋白生物合成过程中易发生错误折叠聚集的关键科学问题，开展了NBD1结构域密码子使用偏好调控翻译动力学的前沿研究。通过核糖体图谱分析发现Leu558位点的天然翻译暂停现象，证实 synonymous codon substitutions 可改变共翻译折叠路径，增强7D12表位可及性并提升成熟CFTR通道的ATP敏感性（KD从281降至177 μM）与开放概率（Po(max)从0.35升至0.46）。该研究首次揭示密码子使用通过构象印记机制平衡蛋白折叠保真度与功能优化的进化策略，为基因治疗中的密码子优化提供重要警示。

　　

在真核细胞中，新生成的多肽链如何正确折叠成具有特定三维结构的蛋白质，是一个关乎生命活动的基础生物学问题。对于囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）这类含有1480个氨基酸的大型膜蛋白而言，其折叠过程尤为复杂且容易出错。CFTR蛋白包含两个跨膜结构域（TMD1和TMD2）、两个核苷酸结合域（NBD1和NBD2）以及一个部分无序的调节区（R区），这些结构域需要协同组装才能形成最终有功能的氯离子通道。其中，NBD1结构域的折叠尤为关键，最常见的囊性纤维化致病突变F508del正是发生在这个区域，导致CFTR蛋白错误折叠而被降解。

以往研究表明，蛋白质折叠不仅取决于氨基酸序列，还受到共翻译过程的深刻影响。在翻译过程中，核糖体沿mRNA移动的速度并非均匀，局部速度变化可能影响新生肽链的折叠路径。那么，CFTR蛋白的mRNA序列中是否存在调控翻译速度的“调速器”？这些“调速器”如何影响CFTR的折叠效率和最终功能？这些都是领域内亟待解答的重要科学问题。

发表在《Scientific Reports》的这项研究为我们揭示了答案。研究人员发现CFTR的NBD1结构域中存在天然的密码子使用偏好，这些“低效率”密码子通过在关键折叠窗口（残基525-593）引入翻译暂停，有效减少了错误折叠中间体的聚集倾向。令人惊讶的是，人为消除这一暂停虽然增强了成熟CFTR通道的功能，却也增加了早期聚集风险，表明天然密码子使用进化出了平衡折叠保真度与功能最优化的精巧策略。

为开展此项研究，团队主要运用了四大关键技术：一是通过核糖体图谱技术（ribosome profiling）在密码子分辨率水平监测CFTR转录本的翻译动力学；二是利用免疫共沉淀（immunoprecipitation）结合表位可及性分析评估蛋白质构象变化；三是通过膜片钳技术（patch-clamp）在HEK293和CHO-K1细胞上记录CFTR单通道活动；四是构建系列CFTR synonymous codon substitutions突变体，通过免疫印迹（immunoblotting）分析蛋白表达与聚集特性。

密码子使用在NBD1α-螺旋亚结构域影响CFTR聚集倾向

研究人员将关键区域（525-593）划分为三个区段（segment-a/b/c），通过引入高效密码子（High-codons）发现，segment-b区段（553-572）的密码子替换会显著增加未成熟CFTR的聚集。核糖体图谱分析显示，高效密码子构建体在segment-b区的核糖体占据密度显著降低，表明翻译速率加快。

翻译暂停发生在CFTR合成过程中的特定密码子位点

在全转录组水平鉴定出11个翻译暂停位点，其中9个发生在亮氨酸（UUA）或谷氨酸（GAA）密码子。值得注意的是，并非所有这类密码子都会引起暂停，说明暂停现象受多因素调控。

Leu558处的转录本编码暂停减少CFTR聚集

Leu558（UUA）是NBD1区段中最显著的暂停位点之一。将UUA替换为高效密码子CUC会消除暂停并增加聚集，而在高效密码子构建体中重新引入UUA则可部分恢复暂停现象并降低聚集。

同义替换影响新合成NBD1的构象特性

通过3G11、7D12和UNC660抗体对NBD1不同表位进行免疫沉淀，发现高效密码子构建体的7D12表位（α-螺旋亚结构域）可及性显著增加，表明局部构象发生改变。

共翻译折叠过程中建立的构象特性在CFTR成熟过程中持续存在

在全长CFTR蛋白中，高效密码子构建体的7D12抗体结合能力同样增强，且这一变化同时存在于未成熟（band B）和成熟（band C）CFTR中，证明共翻译阶段建立的构象印记可延续至成熟蛋白。

共翻译印记增强CFTR通道功能

单通道记录显示，高效密码子构建体的通道开放概率（P_o）显著高于野生型，ATP浓度-反应关系分析表明其ATP亲和力提高（K_D从281降至177 μM），最大开放概率增加（P_o(max)从0.35升至0.46）。

本研究通过多学科技术手段证实，CFTR的天然密码子使用偏好通过调控局部翻译速率，在共翻译折叠阶段对蛋白质构象进行“编程”，这种编程效果可延续至成熟蛋白并影响其功能。特别值得注意的是，密码子优化在提升CFTR通道功能的同时，也增加了早期折叠中间体的聚集风险，揭示了一种进化上的平衡策略——以轻微的功能代价换取更高的折叠保真度。

这一发现对基于mRNA/DNA的CFTR基因治疗策略具有重要警示意义：盲目进行密码子优化可能破坏天然折叠路径，产生不可预见的后果。未来研究需要更精确地解析密码子使用如何在不同细胞环境中影响蛋白质生物合成，为合理设计基因治疗序列提供理论依据。