胰腺原酶对胰腺导管腺癌相关成纤维细胞影响的研究

《Scientific Reports》：Impact of pancreatic proenzymes on pancreatic ductal adenocarcinoma associated fibroblasts

本研究针对胰腺导管腺癌（PDAC）中肿瘤微环境（TME）内癌相关成纤维细胞（CAFs）促肿瘤表型这一关键问题，开展了胰腺原酶（PRP）制剂干预CAFs的研究。结果表明，PRP能抑制TGF-β/Smad通路，下调CAFs标志物（FAPα、SDF1等）表达，上调抑癌标志物Meflin，并选择性诱导CAFs凋亡，从而破坏肿瘤-基质相互作用，逆转CAFs的表型，为PDAC的基质靶向治疗提供了新策略。

　　

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，预后极差，预计到2030年将成为癌症相关死亡的第二大原因。其治疗面临巨大挑战，主要原因包括晚期诊断、治疗选择有限以及高度纤维化的肿瘤微环境（TME）。传统上，癌症研究主要聚焦于癌细胞本身，但近年来，科学家们逐渐认识到，肿瘤并非孤立的细胞团块，而是一个复杂的“生态系统”，其中癌细胞与周围的非癌细胞（即肿瘤微环境）存在着密切且动态的相互作用。在PDAC中，肿瘤微环境尤其特别，它含有异常丰富的间质成分，其中癌相关成纤维细胞（CAFs）扮演着至关重要的角色。

CAFs是肿瘤微环境中的关键“建筑师”和“策动者”。它们通常由正常的成纤维细胞等细胞在癌细胞分泌的信号（如TGF-β）作用下“教育”而成。被激活的CAFs会分泌大量的生长因子、细胞因子并重塑细胞外基质，为癌细胞的生长、迁移、免疫逃逸乃至产生化疗耐药性提供温床。然而，简单地清除所有CAFs并非良策，因为某些CAF亚群可能具有抑制肿瘤的功能，完全清除甚至可能导致肿瘤变得更具侵袭性。因此，当前的研究前沿转向如何“教育”或“重编程”CAFs，使其从“助纣为虐”的帮凶转变为“改邪归正”的伙伴，从而改善肿瘤微环境，增强化疗效果。这就是本研究探索胰腺原酶（PRP）新疗法的核心背景。

为了解决CAFs促进PDAC恶性进展的难题，并探索新的辅助治疗策略，由Belén Toledo和Macarena Perán等人组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们评估了一种含有胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A（比例1:6）的胰腺原酶制剂（PRP）对PDAC模型中介导肿瘤-基质相互作用的影响。该研究旨在阐明PRP是否能通过调控CAFs来破坏肿瘤微环境中的恶性循环。

研究人员综合运用了多种体外和体内实验技术来系统评估PRP的效果。关键实验模型包括：利用Transwell系统建立的间接共培养模型和直接细胞接触共培养模型，以模拟肿瘤细胞与成纤维细胞（包括从人皮肤组织分离的正常相关成纤维细胞NAFs）的相互作用；三维（3D）直接共培养模型（形成细胞团块）用于评估细胞增殖；条件培养基（CM）实验用于分析细胞间的旁分泌作用；伤口愈合划痕实验和克隆形成实验用于检测癌细胞迁移和增殖能力；免疫荧光染色、实时定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western Blot）用于分析关键蛋白和基因的表达变化；流式细胞术用于检测细胞凋亡；并利用了免疫缺陷小鼠的异种移植瘤模型进行体内验证。

研究结果

1. PRP干扰癌细胞诱导的成纤维细胞活化

研究人员首先证实，将人胰腺癌细胞系BxPC3的单层细胞或其衍生的癌症干细胞（BxPC3-CSCs）与正常成纤维细胞（NAFs）共培养，能够成功诱导NAFs转化为具有CAFs特征的细胞。这些被“教育”的CAFs形态变大、呈星状，并高表达CAFs的标志性蛋白，如成纤维细胞活化蛋白α（FAPα）。重要的是，无论在共培养前预处理癌细胞、在共培养过程中直接加入PRP，还是在NAFs已转化为CAFs后再给予PRP处理，都能显著抑制FAPα等CAFs相关基因的表达上调。这表明PRP能够有效阻止正常成纤维细胞获得促肿瘤表型。

2. PRP抑制CAFs对癌细胞的促恶性能力

CAFs通过分泌各种因子极大地影响癌细胞的恶性行为。本研究发现在CAFs条件培养基中培养的BxPC3-CSCs，其上皮-间质转化（EMT）过程被增强，表现为E-钙黏蛋白（上皮标志）表达下降，而N-钙黏蛋白、Vimentin（间质标志）以及转录因子Snail和Slug的表达上升。PRP处理则能逆转这一趋势，促进癌细胞的上皮特性。功能实验进一步显示，CAFs条件培养基能显著促进癌细胞的迁移和克隆形成能力，而PRP处理可以明显削弱CAFs的这种促迁移和促增殖效应。

3. PRP抑制CAFs对正常微环境细胞的“教育”作用

肿瘤微环境中的细胞间会相互影响。研究发现，CAFs分泌的因子甚至能够“教育”其周边的正常成纤维细胞，使其获得促炎表型，这类细胞被称为CAF教育后的成纤维细胞（CEFs）。PRP处理CAFs后，其条件培养基诱导正常成纤维细胞表达促炎细胞因子（如IL-1, IL-6, CXCL8）和CAFs标志物的能力大大降低。这意味着PRP可以打断CAFs在肿瘤微环境中“招募”和“转化”更多帮凶的链条。此外，CAFs还能促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达VE-钙黏蛋白和CD31等血管生成标志物，而PRP处理可以抑制CAFs的这种促血管生成作用。

4. PRP促进CAFs向抑癌表型重编程

研究发现，PRP处理能显著上调CAFs中Meflin的表达。Meflin被认为是一种与肿瘤抑制性CAFs相关的标志物，其高表达通常与更好的肿瘤分化程度和预后相关。这一发现提示，PRP不仅抑制CAFs的促癌特性，还可能主动将其“重编程”为一种具有抗肿瘤潜能的表型。

5. PRP通过抑制TGF-β/Smad通路调控CAFs表型

转化生长因子β（TGF-β）信号通路是CAFs活化和功能的核心调控者。本研究证实，PRP处理能显著降低CAFs中Smad2和Smad3的基因和蛋白表达水平，并抑制其磷酸化（p-Smad2/3）及向细胞核内的转运。Smad蛋白的核转运是TGF-β信号发挥功能的关键步骤。PRP的这种抑制作用与商用TGF-β受体I抑制剂（Galunisertib）的效果相似，表明PRP可能是通过部分阻断TGF-β/Smad这一经典通路来发挥其对CAFs的重编程作用。

6. PRP选择性诱导CAFs凋亡

流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示，PRP处理对正常成纤维细胞（NAFs）的存活没有显著影响，但却能显著增加CAFs的晚期凋亡和坏死比例。在基因水平上，PRP处理能上调CAFs中的促凋亡基因BAX的表达，同时下调抗凋亡基因Bcl-2的表达，导致BAX/Bcl-2比值（凋亡易感性指标）大幅升高超过35倍。这表明PRP对CAFs具有选择性杀伤作用，而对正常基质细胞相对安全。

7. 体内研究验证PRP的抗肿瘤和抗纤维化效果

在免疫缺陷小鼠的胰腺癌异种移植瘤模型中，PRP治疗（无论是在肿瘤诱导前预防性给药，还是在肿瘤诱导前后均给药）显著抑制了肿瘤的生长。对肿瘤组织的分析发现，PRP治疗组的肿瘤内部坏死区域增加，而由CAFs和细胞外基质构成的致密纤维化间质（纤维化屏障）则明显减少。同时，肿瘤组织中促纤维化的Smad2/3蛋白表达下降，而抑癌标志物Meflin的表达则显著上调。这些体内数据有力地支持了PRP能够重塑肿瘤微环境，使其不利于肿瘤生长。

结论与意义

本研究系统深入地探讨了胰腺原酶制剂PRP对胰腺导管腺癌肿瘤微环境，特别是对癌相关成纤维细胞的多方面影响。研究结论表明，PRP能够通过部分抑制TGF-β/Smad信号通路，有效干预CAFs的活化及其功能：它一方面可以阻止正常成纤维细胞被癌细胞“教坏”为促癌的CAFs；另一方面，对于已经存在的CAFs，PRP能将其“重编程”为一种促癌能力较弱的表型（如诱导Meflin表达），甚至选择性诱导其凋亡，同时还能抑制CAFs促进癌细胞EMT、迁移、增殖以及血管生成的能力。

这项研究的重大意义在于，它揭示了一种基于酶疗法的制剂——PRP，作为一种潜在的PDAC基质靶向治疗新策略。与旨在完全清除CAFs的策略不同，PRP侧重于“重编程”和“调控”，这可能避免因彻底破坏肿瘤微环境而可能带来的负面影响。PRP的多靶点作用（同时影响癌细胞和基质细胞）为克服PDAC的化疗耐药和抑制转移提供了新的思路。此外，PRP对CAFs的选择性作用也提示了其可能具有良好的安全性。这些临床前发现为将PRP开发为PDAC的辅助疗法，特别是与现有化疗药物联合使用，奠定了坚实的理论基础，并指明了进一步开展临床研究的方向。