红细胞来源细胞外囊泡与纳米红细胞体的光谱与化学计量蛋白质/脂质比相关性研究

《Scientific Reports》：Correlation between spectroscopic and stoichiometric protein to lipid ratios in erythrocyte-derived extracellular vesicles and nanoerythrosomes

本研究针对红细胞来源细胞外囊泡(RBCEVs)和纳米红细胞体(NERYs)的蛋白质/脂质比定量分析难题，开发了基于ATR-FTIR光谱的快速检测方法。研究人员通过系统添加DPPC磷脂构建系列样本，发现光谱信号与化学计量比之间存在线性相关(R2>0.94)，建立了无需传统脂质分析即可估算脂质浓度的新策略，为纳米载体制剂的质量控制提供了重要技术支撑。

　　

在生物医学领域，红细胞因其独特的生物相容性和长循环特性，已成为药物递送系统开发的重要灵感来源。然而，源自红细胞的两种关键纳米颗粒——天然产生的红细胞来源细胞外囊泡(RBCEVs)和人工制备的纳米红细胞体(NERYs)——其质量控制仍面临挑战。特别是准确快速测定这些纳米颗粒中蛋白质与脂质的比例，对于保证其批次一致性和功能可靠性至关重要。传统生化分析方法虽精度较高，但操作繁琐、样品消耗量大，难以满足高通量筛选的需求。

为此，Attila Bota等研究团队在《Scientific Reports》上发表论文，创新性地将衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)技术应用于红细胞来源纳米颗粒的快速表征。研究人员通过巧妙设计实验方案，系统研究了不同DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)添加量对NERYs和RBCEVs形态、结构及光谱特性的影响，建立了光谱信号与化学计量比之间的定量关系模型。

研究团队综合运用冷冻断裂透射电镜(FF-TEM)、小角X射线散射(SAXS)、差示扫描量热法(DSC)和ATR-FTIR等多种表征技术。实验样本包括从健康志愿者新鲜血液中分离的红细胞膜(鬼影)、RBCEVs以及通过超声处理和挤出制备的NERYs。研究人员通过系统添加DPPC构建了不同蛋白质/脂质比例的样本系列，采用Bradford法和微BCA法进行蛋白质定量，SPV法进行脂质分析，并详细表征了各样本的形态结构变化和光谱特征。

蛋白和脂质分析结果

通过Bradford、微BCA和SPV等多种分析方法对红细胞膜和RBCEVs的蛋白脂质组成进行系统量化。数据显示红细胞膜中蛋白质含量约为4.01±0.33 mg/mL(Bradford法)，脂质含量为3.53±0.15 mg/mL，蛋白质/脂质比约为1.14，与文献报道的50:40(蛋白质:脂质)重量比基本一致。而RBCEVs样本的蛋白浓度(0.89±0.026 mg/mL)明显较低，且SPV法测得的脂质值显著低于估算值，表明RBCEVs的组成与原始红细胞膜存在差异。

DPPC修饰NERYs的形态结构特征

冷冻断裂电镜观察显示，未均质化的鬼影样本呈现大片膜结构和不同尺寸的球形颗粒(图1A)。添加1倍DPPC并通过挤出处理后，形成均匀的球形NERYs，表面分布有膜蛋白和蛋白聚集体(图1B)。当DPPC添加量增至5倍时，体系中出现紧密堆积的颗粒群，部分额外添加的DPPC形成片层结构覆盖在NERYs表面(图1C)。10倍DPPC添加量导致更显著的形态变化，形成被骨架膜蛋白网络覆盖的多角形结构(图1D)。

SAXS分析进一步揭示了DPPC添加对膜层状结构的影响。随着DPPC比例增加，磷脂双分子层形状因子逐渐增强，在10倍DPPC样本中出现明显的卫星峰，表明NERYs双分子层中DPPC富集程度提高。DSC结果显示，除10倍DPPC样本出现微弱相变外，其他样本在20-50°C范围内均未观察到明显的一级相变，证实了DPPC与鬼影膜的良好整合。

NERYs中光谱与化学计量蛋白质/脂质比的相关性

ATR-FTIR光谱分析显示，随着DPPC添加量增加，脂质特征吸收峰发生系统性变化。CH₂伸缩振动强度随脂质含量增加而增强，且振动峰位逐渐向纯DPPC的特征位置偏移(图3A)。酰胺I带和酰胺II带的变化表明蛋白质微环境发生重构，β-折叠结构减少。

研究人员分别基于CH₂/CH₃伸缩振动和羰基伸缩振动计算光谱蛋白质/脂质比，发现与化学计量比之间存在良好的线性关系。以CH振动为基准时，相关性系数R²=0.9667；以羰基振动为基准时，R²=0.9842(图4)。这种线性关系为快速估算脂质浓度提供了理论依据。

DPPC修饰RBCEVs的形态结构特征

RBCEVs在形态上表现为100-200纳米的单分散球形颗粒，表面密集分布蛋白质聚集体(图5A)。低浓度DPPC添加(1-2倍)仅引起轻微形态改变，而5倍DPPC添加导致体系发生相分离，形成DPPC富集的片层结构包裹RBCEVs聚集体(图5C)。10倍DPPC添加则引起更显著变化，出现独立的层状脂质堆积(图5D)。

SAXS分析证实了DPPC整合的局限性。低DPPC比例样本呈现典型的囊泡散射曲线，而高比例样本出现布拉格反射，表明形成了多层脂质结构(图6A)。DSC结果显示明显的链熔融信号，进一步证实了DPPC域的存在(图6B)。

RBCEVs中光谱与化学计量蛋白质/脂质比的相关性

与NERYs类似，RBCEVs的光谱信号也随DPPC添加发生规律性变化(图7)。基于CH振动和羰基振动的光谱蛋白质/脂质比与化学计量比均呈现良好线性关系，相关性系数分别为R²=0.9457和R²=0.9948(图8)。通过优化算法反推，研究人员计算出RBCEVs的脂质浓度为0.72 mg/mL，与基于Bradford法的估算值(0.71 mg/mL)高度吻合。

本研究通过系统实验证实，ATR-FTIR光谱法能够快速、准确地评估红细胞来源纳米颗粒的蛋白质/脂质组成。尽管NERYs和RBCEVs在DPPC整合能力上存在差异——NERYs可容纳高达10倍于蛋白质量的DPPC，而RBCEVs的整合能力有限——但两种体系的光谱信号均与化学计量比呈线性相关。这种相关性为纳米药物制剂的快速质量评估提供了新思路，特别适用于需要高通量筛选的临床应用场景。

研究建立的标准化工作流程，结合标准添加法的优势，使得无需传统脂质分析即可估算脂质浓度成为可能。该方法对实验室制备条件的微小变化具有敏感性，建议在实际应用中建立具体的校准曲线。特别是在化学计量比接近1的范围内，增加数据点密度有助于提高准确性。这一技术突破为红细胞来源纳米颗粒的质量控制提供了有力工具，有望推动其在药物递送、诊断检测等领域的广泛应用。