慢性HBV患者HBx基因新发突变的发现及其结构特征解析

《Scientific Reports》：Discovery and structural characterization of newly identified mutations in the HBx gene of chronic HBV patients

本研究针对中东人群慢性HBV感染者HBx基因变异特征不明的问题，通过HRM筛选和Sanger测序技术，在基因型D优势人群中鉴定出G37A/G73V等新型甘氨酸替代突变。结构建模提示突变可能引起C末端反式激活域构象变化，为揭示HBx突变体在病毒持久性及肝癌发生中的机制提供了新的分子线索。

　　

在全球范围内，乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是导致慢性肝病和肝细胞癌（HCC）的主要病因，约有3亿慢性感染者。HBV X蛋白（HBx）作为病毒复制和宿主信号通路调控的关键因子，在慢性感染向HCC转化过程中扮演着核心角色。然而，HBx基因序列在不同人群中的变异特征，特别是中东地区以基因型D感染为主的伊朗人群，尚未得到充分解析。此前研究表明，HBx特定突变可通过改变蛋白功能影响疾病严重程度和治疗反应，但相关突变在结构性层面的作用机制仍不明确。

为填补这一研究空白，来自克尔曼医科大学的研究团队在《Scientific Reports》发表了最新成果。研究人员收集了50例慢性HBV感染者的血清样本，通过高分辨率熔解曲线（HRM）分析进行初步突变筛查，并选取4例具有异常熔解谱的代表性样本进行Sanger测序。研究重点聚焦于HBx基因的非同义突变，利用SWISS-MODEL进行三维结构建模，结合系统发育分析和蛋白互作网络（PPI）预测，系统评估了新发现突变的结构潜在功能影响。

关键技术方法包括：从患者血清中提取病毒DNA后，采用HRM技术快速筛查HBx基因变异；对筛选出的异常样本进行全长PCR扩增和Sanger测序；通过最大似然法构建系统发育树确定基因型；使用SWISS-MODEL预测突变蛋白的三维结构；利用STRING数据库分析HBx与宿主蛋白的相互作用网络。

患者样本与临床特征

研究纳入的4例代表性患者中，Kerman_3样本显示最高病毒载量（5600 IU/mL）和显著升高的肝功能指标（ALK-P: 552 U/L，SGOT: 251 U/L，SGPT: 265 U/L），且HBeAg阳性。其余患者病毒载量较低（450-829 IU/mL），肝功能指标中度异常，HBeAg均为阴性。这种临床异质性为后续突变功能分析提供了多样化的生物学背景。

HRM筛查与突变鉴定

HRM分析显示4例样本的熔解曲线明显偏离野生型参考模式，提示存在核苷酸变异。Sanger测序结果证实了5个新发现的非同义突变：G37A、G43D、G73V（在Kerman_17和Kerman_19中重复出现）、P32H以及1个同义突变c.312T>C。值得注意的是，G73V突变位于HBx反式激活域（aa 51-140），该区域已知参与转录调控和致癌过程。

系统发育分析

最大似然法构建的系统发育树显示，所有克尔曼分离株均与基因型D参考株（如U95551.1）紧密聚类，自举值超过70%，证实该队列中基因型D的优势地位。Kerman_3与D5亚型（AB109475）亲缘关系最近，而Kerman_17和Kerman_19显示出更高的遗传分歧，提示可能存在独特的突变事件。

结构建模与功能预测

全长HBx结构模型显示，新发现的甘氨酸替代突变（G37A、G43D、G73V）集中分布于C末端α螺旋反式激活域附近。该区域具有结构柔性和功能重要性，甘氨酸残基的替换可能影响局部构象动态。虽然计算模拟未预测到显著结构破坏，但突变可能通过微调螺旋稳定性间接影响HBx与宿主蛋白（如TP53、BAX、CREB1）的相互作用。

蛋白互作网络分析

STRING数据库分析揭示了HBx与凋亡（BAX、CFLAR）、炎症（IL6、TNF）及转录调控（CREB1、TP53）相关通路的关键连接。尽管研究未直接验证突变对互作网络的影响，但突变簇位于功能域的现象提示其潜在调控价值。

本研究通过多维度分析揭示了伊朗人群慢性HBV感染者HBx基因的新型突变谱，特别是甘氨酸替代突变在反式激活域的结构聚类特征。虽然临床关联性受限于样本量，但G73V突变与高病毒载量的共存现象为后续功能研究提供了方向。这些发现不仅扩展了基因型D中HBx变异的数据库，更为理解突变体在病毒持久性和肝癌发生中的机制提供了结构生物学基础。未来需通过大规模队列和功能实验验证这些突变对HBx转录活性、宿主信号通路调控及致癌潜能的具体影响。