古蛋白质组学中牙釉质污染识别与清除：提升 Pleistocene 生物分子信息回收可靠性的关键步骤

《Scientific Reports》：Identification and removal of contamination in palaeoproteomic analysis of dental enamel

本研究针对古牙釉质蛋白质组分析中现代蛋白污染导致的低丰度内源性肽段丢失问题，系统评估了五种去污染方法。通过人工污染 Pleistocene 披毛犀牙齿样本并对比水、漂白剂、HCl、EDTA 清洗及紫外线照射的效果，发现水洗法能高效去除污染且最大程度保留内源性蛋白信息，而漂白剂处理可能损失短肽段。该研究为古牙釉质样本前处理提供了标准化方案，对提升系统发育与性别鉴定研究的准确性具有重要意义。

　　

在探索远古生命的奥秘时，科学家们常借助古蛋白质组学（palaeoproteomics）技术，通过分析古代生物遗骸中的蛋白质来揭示物种的分类地位、演化关系甚至个体性别。牙釉质作为脊椎动物体内最坚硬的组织，因其高矿化度而具有极佳的蛋白质保存潜力，已成为研究数百万年前生物分子的重要材料。然而，这类研究面临一个关键挑战：现代蛋白质污染可能掩盖内源性古蛋白信号，导致关键信息丢失。尽管牙釉质蛋白具有组织特异性，且提取流程通常省略酶切步骤（因釉质蛋白在体内已由蛋白酶预处理），但污染对数据质量的实际影响一直缺乏实验验证。

为解决这一问题，哥本哈根大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表论文，首次通过人工污染实验系统评估了牙釉质古蛋白质组分析中污染的干扰效应，并比较了五种去污染方法的优劣。研究选取晚更新世（Pleistocene）披毛犀（Coelodonta antiquitatis）牙齿样本，用狗唾液模拟长期埋藏中引入的复杂污染，随后采用水、漂白剂（钠次氯酸盐）、盐酸（HCl）、乙二胺四乙酸（EDTA）清洗及紫外线（UV）照射进行去污染处理，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术分析蛋白回收效果。

关键方法概述

研究以披毛犀牙釉质粉末为样本，人工添加狗唾液模拟污染，对比未去污染组与五种去污染方法（水、0.5%漂白剂、1% HCl、0.5 M EDTA清洗及254 nm紫外线照射）的效果。蛋白提取采用标准古牙釉质流程，包括盐酸脱矿、StageTip脱盐，并通过MaxQuant软件进行非特异性酶切数据库搜索，重点分析釉质特异性蛋白（如釉原蛋白AMEL*、釉鞘蛋白AMBN、釉蛋白ENAM）的肽段识别数、覆盖度及修饰水平。

污染导致内源性蛋白信息显著丢失

尽管污染蛋白本身因未酶切而无法被质谱识别，但其存在严重抑制了内源性釉质蛋白的检测。与未污染样本相比，污染组的MS2谱图识别率、肽段和蛋白数量均显著下降，尤其是低丰度蛋白如基质金属蛋白酶20（MMP20）完全无法检出。

覆盖度分析进一步显示，污染使釉原蛋白（AMEL*）和釉鞘蛋白（AMBN）的特定区域（如氨基酸位点80-100）信号完全丢失，表明污染非随机干扰，而是优先掩盖低强度肽段。

水洗法为最优去污染策略

比较五种方法后发现，水洗能最大程度恢复内源性蛋白信息，其肽段识别数、覆盖度及修饰水平（如丝氨酸磷酸化比例）均与未污染样本无显著差异。漂白剂处理虽能有效去污，但可能选择性去除晶间短肽，导致平均肽段长度轻微增加。

蛋白区域覆盖分析证实，水洗法能恢复釉原蛋白和釉鞘蛋白的关键区域，而漂白剂处理可能损失釉蛋白（ENAM）N端片段。

统计显示，水洗后釉质蛋白覆盖氨基酸位数最接近原始样本，且肽段疏水性与磷酸化水平均与污染前状态一致。

结论与意义

本研究首次实证了牙釉质古蛋白质组分析中不可见的蛋白污染会导致内源性信息严重失真，尤其影响低丰度蛋白及多态性区域的回收，可能误导系统发育或性别鉴定结论。水洗法作为一种简单、低成本的前处理步骤，能显著提升数据可靠性，适用于高降解样本。这一发现填补了古蛋白质组学样本前处理标准化流程的空白，为未来研究尤其是珍贵考古材料的分析提供了关键技术支撑。