苹果油来源熊果酸治疗色素沉着障碍的分子机制与临床评价研究

《Scientific Reports》：Apple oil as a source of ursolic acid for the treatment of hyperpigmentary disorders with molecular and clinical evaluation

本研究针对皮肤色素沉着这一常见问题，开发了富含熊果酸(UA)的安努尔卡苹果油(AAO)提取物。通过体外实验证实AAO可有效抑制酪氨酸酶活性(IC50=286.42μg/mL)，下调A375黑色素瘤细胞中TYR、TYRP-1、TYRP-2和MITF基因表达，并调节氧化应激标志物。临床随机对照试验显示，含2.5%AAO的制剂使用28天后显著改善ITA°(+12.4%)、L*(+3.1%)和黑色素指数(-10.2%)。该研究为天然来源的多靶点美白成分提供了新选择。

　　

当阳光亲吻肌肤，黑色素便开始了一场复杂的"保卫战"。这种由黑色素细胞合成的生物色素，本是皮肤对抗紫外线辐射的自然防线，但当其合成失衡时，却会引发色素沉着、黄褐斑和老年斑等令人困扰的皮肤问题。黑色素生成是一个多步骤的精密过程，始于酪氨酸在酪氨酸酶(TYR)催化下氧化为多巴醌，随后经过一系列氧化聚合反应最终形成黑色素。这一过程受到多种分子调控，特别是紫外线照射会诱导α-黑色素细胞刺激激素(α-MSH)合成，通过激活cAMP通路增加小眼畸形相关转录因子(MITF)表达，进而调控TYR、TYRP-1和TYRP-2等关键蛋白的表达。

更为复杂的是，黑色素细胞相较于其他细胞类型具有更高的活性氧(ROS)水平，这与黑色素合成过程中伴随的氧化应激密切相关。研究表明，多种色素性皮肤病如白癜风，都与Nrf2相关抗氧化酶系统的功能紊乱有关，包括γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCLC、GCLM)和血红素加氧酶-1(HMOX-1)等。这种黑色素生成与氧化应激之间的双向关联，使得开发同时具有抗氧化和调节黑色素生成双重功能的天然化合物成为研究热点。

在众多天然活性成分中，熊果酸(Ursolic Acid, UA)这一富含于苹果皮中的三萜酸类化合物引起了研究人员的特别关注。前期研究表明UA具有显著的酪氨酸酶抑制活性(IC₅₀: 170.2 μM)，而意大利传统品种安努尔卡苹果(Annurca Apple, AA)更是被证实含有异常丰富的UA(9.09 mg/g DW)和总三萜含量(14.19 mg/g DW)。虽然AA的多酚类成分在调节血脂和血糖方面的功效已被广泛证实，但其三萜类成分在皮肤健康领域的应用潜力仍有待挖掘。

基于此，Maria Maisto、Vincenzo Piccolo等研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，系统探讨了安努尔卡苹果油(AAO)作为UA天然来源在治疗色素沉着障碍中的应用潜力。研究团队通过标准化提取工艺获得UA浓度为784.40±7.58μg/mL的AAO提取物，并采用多维度研究策略，从分子机制到临床疗效全面评估了AAO的色素沉着改善作用。

研究采用的关键技术方法包括：通过高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)测定酪氨酸酶抑制活性；利用A375人黑色素瘤细胞模型评估 melanin含量及TYR、TYRP-1、TYRP-2、MITF等基因的mRNA表达；采用流式细胞术分析ROS产生和线粒体功能；并开展了一项纳入42名色素沉着受试者的随机双盲安慰剂对照临床试验，通过VISIA系统、Mexameter和皮肤色度计等仪器客观评价临床疗效。

2.1. 酪氨酸酶抑制实验

研究人员首先评估了AAO对酪氨酸酶的直接抑制作用。结果显示，AAO以浓度依赖的方式有效抑制酪氨酸酶活性，IC₅₀值为286.42μg/mL。为确认UA是主要活性成分，研究人员同时测试了纯品UA的抑制活性，其IC₅₀为26.82μg/mL，约为AAO活性的10倍，这与UA在AAO中的含量比例相符。阳性对照曲酸(KA)显示出最强的抑制活性(IC₅₀: 0.59μg/mL)，与文献报道一致。

2.2 AAO对人黑色素瘤细胞增殖的影响

为确定合适的实验浓度，研究团队通过MTT法评估了AAO和UA对A375细胞活力的影响。结果显示，100μg/mL的AAO才开始影响细胞活力，而UA在10μg/mL时即显示出细胞毒性。因此，后续实验选择30μg/mL AAO和3μg/mL UA作为工作浓度。

2.3 AAO减少黑色素生成和黑色素生成相关基因表达

在α-MSH刺激的A375细胞中，AAO(30μg/mL)和UA(3μg/mL)处理72小时后均显著降低黑色素生成。更为重要的是，qPCR分析显示AAO能显著下调TYR、TYRP-1、TYRP-2和MITF的mRNA表达水平。具体而言，α-MSH使TYR表达增加约1.5倍，而AAO将其降低至MSH组的0.39倍(较对照降低61%)；TYRP-1表达在MSH刺激下增加1.4倍，AAO将其降至MSH组的0.58倍(降低42%)；TYRP-2和MITF也呈现类似趋势，AAO分别将其表达降至MSH组的0.40倍和0.44倍。

2.4 AAO对ROS产生的调节作用

鉴于黑色素生成与氧化应激的密切关系，研究团队进一步探讨了AAO的抗氧化潜力。在Fenton试剂诱导的氧化应激模型中，AAO和UA预处理均能显著降低ROS产生。同时，AAO显著上调抗氧化酶GCLC、GCLM和HMOX-1的表达，而UA主要诱导HMOX-1表达。在氧化应激条件下，MITF和TYR表达均增加，而AAO和UA预处理能有效逆转这一趋势。在α-MSH刺激模型中，AAO和UA同样表现出降低ROS产生的效果，证实了其在黑色素生成相关氧化应激中的调节作用。

2.5. 临床数据

临床研究纳入42名女性受试者，多数为45-55岁(71.4%)，Fitzpatrick皮肤类型以II型为主(66.7%)。结果显示，与安慰剂组相比，使用含2.5% AAO制剂28天后，治疗组在多个色素沉着相关参数上均有显著改善：个体类型角(ITA°)增加12.4%，亮度值(L*)提高3.1%，黑色素指数(MI)降低10.2%。同时，UV斑和棕色斑点评分也显著降低(-6.4%和-4.1%)，且未观察到皮肤刺激或脱屑等不良反应。

本研究首次系统阐明了AAO通过多靶点机制改善色素沉着的功效。在分子水平，AAO不仅直接抑制酪氨酸酶活性，还通过下调MITF转录因子及其下游靶基因TYR、TYRP-1和TYRP-2的表达，从转录层面抑制黑色素生成。同时，AAO通过上调GCLC、GCLM和HMOX-1等抗氧化酶的表达，增强细胞抗氧化防御能力，减少氧化应激对黑色素生成的促进作用。这种双重调节机制在α-MSH和Fenton刺激模型中均得到验证，凸显了AAO在多因素导致的色素沉着中的综合调控优势。

临床研究结果进一步证实了AAO的实际应用价值。与经典美白成分如氢醌相比，AAO具有更好的安全性和可持续性，其来源于苹果皮废弃物的特点也符合循环经济理念。虽然本研究样本量有限，但结果为AAO在化妆品和皮肤病学配方中的应用提供了初步的临床证据。

综上所述，安努尔卡苹果油作为熊果酸的天然来源，展现出作为多功能皮肤美白成分的巨大潜力。其通过抑制酪氨酸酶、调节黑色素生成关键基因表达和增强抗氧化防御的多重机制，为开发安全有效的色素沉着管理策略提供了新思路。未来研究可进一步扩大样本量，探索AAO在不同类型色素沉着疾病中的长期疗效，以及与其他活性成分的协同作用，推动这一天然资源在皮肤健康领域的更广泛应用。