基于丝状马铃薯X病毒（PVX）的核酸递送纳米技术平台构建及其在基因治疗中的应用研究

《Scientific Reports》：Engineering filamentous potato virus X as a platform nanotechnology for nucleic acid gene delivery

本研究针对核酸药物递送系统稳定性差、靶向性不足等挑战，创新性地利用植物病毒PVX的衣壳蛋白自组装特性，开发了可程序化装载线性mRNA和环状RNA（circRNA）的纳米递送平台。研究通过体外重组技术成功构建了尺寸可控的病毒样颗粒（VLP），并验证其可有效保护核酸免于降解，在哺乳动物细胞中实现靶蛋白表达。该技术为核酸药物的高效递送提供了新型生物材料策略，兼具可定制性和生产经济性优势。

　　

随着mRNA疫苗在抗击COVID-19疫情中的成功应用，核酸药物正掀起一场精准医疗的革命。然而，这些充满潜力的治疗手段面临一个关键瓶颈：如何安全、高效地将脆弱的核酸分子递送到目标细胞内部？现有的递送系统，如脂质纳米颗粒（LNP），虽已取得临床突破，但仍存在靶向性局限（主要富集于肝脏）、需要苛刻的低温储存条件等问题。与此同时，哺乳动物病毒载体虽能高效递送，但其免疫原性和生产复杂性限制了广泛应用。自然界中，病毒是高效的核酸递送“专家”，它们经过亿万年的进化，形成了保护并递送遗传物质的精巧机制。能否向自然界“借”一种更安全、更稳定的病毒作为蓝图，构建新一代递送工具？

在这篇发表于《Scientific Reports》的论文中，研究团队将目光投向了植物界，选择了一种感染马铃薯的病毒——马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）。PVX是一种丝状、柔韧的植物病毒，其病毒颗粒由约1300个相同的衣壳蛋白（Coat Protein, CP）亚基螺旋排列而成，包裹着一条约6.4 kb的单链RNA基因组。研究人员看中了它的几个独特优势：其一，其丝状结构理论上能容纳更大的核酸载荷；其二，其衣壳蛋白易于进行基因工程改造和化学修饰；其三，作为植物病毒，它在哺乳动物系统中具有更高的安全性；其四，它可以通过植物分子农业或细菌发酵大规模、低成本生产，符合可持续发展理念。

研究团队提出了一个核心设想：能否将PVX的衣壳蛋白拆解，然后在体外以其为“积木”，以人工设计的mRNA或新兴的环状RNA（circRNA）为“图纸”，重新组装成定制化的病毒样颗粒（Virus-Like Particle, VLP），从而打造一个全新的核酸药物递送平台？为了验证这一设想，他们开展了一系列精巧的实验。

主要关键技术方法

本研究综合利用了分子克隆、体外转录（IVT）制备带PVX基因组起源组装序列（OAS, Stem-loop 1）的EGFP（增强型绿色荧光蛋白）报告基因mRNA和circRNA。PVX衣壳蛋白（CP）通过两种方式获得：从本氏烟（Nicotiana benthamiana）中繁殖并纯化天然PVX后解离，或通过大肠杆菌（Escherichia coli）重组表达带His标签的CP（rCP-His）。通过体外自组装反应，将CP与RNA模板按特定质量比混合，形成VLP。采用尺寸排阻色谱（SEC）和透射电子显微镜（TEM）系统地表征了VLP的纯度、尺寸和形态。通过免疫金标记TEM和Western blot验证了重组CP在混合组装VLP中的掺入。最后，在BHK-21和HEK 293T等哺乳动物细胞系中，通过脂质体（Lipofectamine 2000）辅助转染，利用流式细胞术、定量RT-PCR和共聚焦显微镜评估了VLP递送核酸并表达报告蛋白的效率及其对RNA酶（RNase）的耐受性。

研究结果

PVX VLPs可封装不同长度的RNA货物

研究人员首先探索了PVX VLP的尺寸可控性。他们设计并体外转录了长度从100 bp到6.4 kb不等的PVX基因组RNA（gRNA）片段作为组装模板。

透射电子显微镜（TEM）观察和尺寸统计分析表明，虽然未能实现绝对的精确尺寸控制，但VLP的长度随着所用RNA模板长度的增加而呈现增大的趋势。例如，用6.4 kb全长基因组组装出的VLP中位长度约为616.6纳米，而用3 kb片段组装出的VLP中位长度约为331纳米。有趣的是，组装在较短RNA模板（如250 nt和500 nt）上的VLP形态更接近刚性棒状，而组装在≥1-kb模板上的VLP则呈现出PVX典型的丝状形态。尺寸控制的偏差可能源于组装反应中较长RNA片段的污染、较短RNA的首尾连接形成多聚体，或CP成核机制的过度延伸导致形成超出RNA模板长度的空管末端。

PVX VLPs可与野生型和His标记的CPs进行混合组装

为了赋予VLP平台功能化的潜力（例如未来连接靶向配体），研究团队成功在大肠杆菌中表达了N末端带有9xHis标签的重组CP（rCP-His）。他们发现，单纯的rCP-His无法有效组装成VLP，但当与从植物中提取的天然CP以特定比例混合时，则可以形成结构完整的混合VLP。实验表明，当rCP-His与天然CP的比例在7:3到1:9之间时，能够成功组装出VLP；而当rCP-His比例过高（如8:2, 9:1, 10:0）时则组装失败，表明一定量的天然CP对于启动正确的成核和组装至关重要。

通过使用10 nm Ni-NTA-纳米金进行免疫金标记TEM和Western blot（Goldiblot）分析，研究人员证实了rCP-His成功掺入到混合VLP中。统计分析显示，随着组装混合物中rCP-His比例的增加，每个VLP上结合的纳米金颗粒数量也显著增加，这为未来通过His标签进行靶向配体等功能分子的精确修饰奠定了基础。

PVX VLPs能够包装外源IVT mRNA并在哺乳动物细胞中实现递送和蛋白表达

研究的核心目标是验证PVX VLP作为功能性核酸递送工具的潜力。研究人员设计了一个包含PVX起源组装位点（SL1）和EGFP报告基因的mRNA构建体（EGFP-SL1 mRNA），并通过体外组装将其封装入PVX VLP中。

尺寸排阻色谱（SEC）和TEM表征证实，成功组装出了具有典型丝状结构的EGFP-SL1 VLPs。细胞实验表明，在脂质体转染试剂辅助下，装载mRNA的VLPs能够有效地将EGFP基因递送至BHK-21细胞，并实现高水平的蛋白表达。更重要的是，当用RNA酶（RNase A）处理时，游离的mRNA其转染效率急剧下降，而被封装在VLP内的mRNA则受到了显著保护，其基因表达效率远高于经相同处理的游离mRNA。这证明了PVX VLP有效保护核酸货物免受降解的能力。从VLP中回收的mRNA经定量RT-PCR验证，其完整性良好。

PVX CPs能够封装circRNA形成光环状VLPs

环状RNA（circRNA）因其闭合环状结构而具有比线性mRNA更高的稳定性，是极具前景的核酸药物形式。研究团队进一步挑战了PVX平台的灵活性，尝试用它来封装结构迥异的circRNA。他们设计了一个包含SL1序列的EGFP报告基因circRNA，并通过体外环化反应成功制备。

令人惊叹的是，PVX CP成功地在circRNA模板上进行了组装，形成了独特的“光环状”（halo-shaped）纳米颗粒（circVLP）。TEM显示这些颗粒的直径约为191.2纳米，比其circRNA模板（直径约305.5纳米）更为紧凑，证实了包装的发生，尽管可能由于空间位阻等原因，部分组装并不完全。在HEK 293T细胞中，这些circVLPs成功递送了circRNA并实现了EGFP蛋白的持续表达（长达96小时），其效率与游离的circRNA对照相当，展示了PVX平台在递送新型核酸形式方面的能力。

研究结论与意义

本研究成功地将丝状植物病毒PVX开发为一个高度通用的核酸递送纳米技术平台。该平台的核心优势在于其多功能性：能够包装不同长度（最高至6.4 kb）和不同形态（线性mRNA和环状circRNA）的RNA货物；其可工程化特性：允许通过混合组装的方式掺入重组功能化CP（如His标签CP），为后续引入靶向分子等功能元件打开了大门；以及其生物相容性与保护能力：初步细胞实验证明其能有效递送核酸并实现功能蛋白表达，同时为装载的核酸提供显著的酶解保护。

尽管在尺寸精确控制方面仍需进一步优化，但这项研究标志着在利用植物病毒VLPs作为核酸治疗载体方面取得了重要进展。与传统的LNP和哺乳动物病毒载体相比，PVX平台展现出在稳定性（可能降低对冷链的需求）、生产成本、可定制性以及安全性（植物病毒对哺乳动物无致病性）上的潜在优势。未来，通过优化组装条件、精确控制颗粒尺寸和形状，并利用其可工程化的表面（如通过His标签连接靶向配体），PVX VLP平台有望发展成为一款强大的、可定制的核酸药物“纳米快递车”，为治疗癌症、遗传病、传染病等多种疾病提供新的解决方案。这项工作为下一代生物衍生纳米医药材料的设计开辟了新的道路。