长链非编码RNA UGDH-AS1编码的微肽NKSM通过抑制c-Myc磷酸化调控NK细胞功能促进三阴性乳腺癌进展

《Nature Communications》：The long non-coding RNA UGDH-AS1 encodes an NK-cell-inhibiting micropeptide in triple-negative breast cancers

本研究针对三阴性乳腺癌（TNBC）中NK细胞功能失调的难题，发现肿瘤浸润NK细胞特异性表达的lncRNA UGDH-AS1可编码新型微肽NKSM。机制研究表明，TGF-β/SMAD通路转录激活UGDH-AS1表达，其编码产物NKSM通过干扰ERK1/2介导的c-Myc Ser62磷酸化降低c-Myc稳定性，进而抑制转录因子T-bet表达，最终导致NK细胞杀伤功能受损。该研究为TNBC免疫治疗提供了新靶点。

　　

在女性恶性肿瘤中，乳腺癌的发病率和死亡率长期高居榜首。其中，三阴性乳腺癌（TNBC）作为一种缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达的亚型，因其对传统内分泌治疗和靶向治疗不敏感，成为临床治疗中最棘手的难题之一。尽管免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）等新型免疫疗法取得了显著进展，但TNBC患者仍然面临较高的复发率和较差的预后。因此，深入探索TNBC的免疫逃逸机制，并开发新的免疫治疗策略迫在眉睫。

自然杀伤（NK）细胞作为先天免疫系统的核心成员，具有快速识别并清除异常细胞（如肿瘤细胞、病毒感染的细胞）的能力。与T细胞不同，NK细胞无需抗原预先致敏即可发挥杀伤作用，尤其擅长攻击主要组织相容性复合体I类分子（MHC-I）表达下调的肿瘤细胞，这使其在肿瘤免疫治疗中具有独特优势。然而，在复杂的肿瘤微环境（TME）中，浸润的NK细胞常常功能失调，处于“失能”状态，严重削弱了其抗肿瘤能力。已有研究表明，转化生长因子-β（TGF-β）等免疫抑制因子在肿瘤微环境中富集，是导致NK细胞功能受抑的关键因素。但TGF-β具体通过何种分子机制精确地“关闭”NK细胞的活性开关，仍有待深入阐明。

近年来，长链非编码RNA（lncRNA）在肿瘤发生发展和免疫调控中的作用日益受到关注。传统上认为lncRNA是不编码蛋白质的RNA分子，但越来越多的证据表明，一部分被标注为lncRNA的转录本实际上具有编码短肽或微肽的能力。这些隐藏的“微肽”可能在细胞生命活动中扮演着重要角色。那么，在TNBC的免疫微环境中，是否存在由lncRNA编码的、能够调控NK细胞功能的微肽？这个问题激发了研究人员的浓厚兴趣。

为了解决上述问题，研究人员在《Nature Communications》上发表了题为“The long non-coding RNA UGDH-AS1 encodes an NK-cell-inhibiting micropeptide in triple-negative breast cancers”的研究论文。该研究通过整合分析TNBC、激素受体阳性（HR+）和HER2阳性（HER2+）乳腺癌患者的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，发现了一个TNBC特异性的NK细胞亚群，其显著特征是高表达lncRNA UGDH-AS1。功能实验证实，UGDH-AS1能够编码一个名为NKSM（NK cell suppressor micropeptide）的微肽，该微肽是导致NK细胞功能抑制的关键分子。机制上，肿瘤微环境中的TGF-β信号通路激活后，其下游效应分子SMAD2/3/4复合物结合到UGDH-AS1的启动子区域，促进其转录表达。随后，UGDH-AS1编码的NKSM微肽与癌蛋白c-Myc直接相互作用，特异性地阻碍了ERK1/2激酶对c-Myc蛋白第62位丝氨酸（Ser62）的磷酸化修饰。c-Myc Ser62磷酸化是其维持蛋白稳定性的重要条件，该位点磷酸化受阻导致c-Myc蛋白更容易被降解，其蛋白水平下降。c-Myc作为重要的转录因子，其活性降低后，无法有效启动下游关键基因的表达，其中包括对NK细胞功能至关重要的转录因子T-bet。T-bet表达下调，进而导致NK细胞分泌效应分子如颗粒酶B（GZMB）、穿孔素（PRF1）和干扰素-γ（IFN-γ）的能力显著减弱，最终使得NK细胞丧失杀伤肿瘤细胞的能力。在动物模型中，研究人员发现，在NK细胞中特异性敲入NKSM会促进TNBC肿瘤的生长和转移；反之，敲除NKSM则能显著增强NK细胞的抗肿瘤活性，抑制肿瘤进展。这项研究不仅揭示了TNBC中NK细胞功能失调的一条全新机制，识别了UGDH-AS1/NKSM这一潜在的免疫治疗新靶点，也为开发基于NK细胞的TNBC免疫疗法提供了坚实的理论依据和实验支持。

为完成此项研究，作者综合运用了多种关键技术方法。研究队列包含了来自苏州大学附属医院的TNBC、HR+和HER2+乳腺癌患者组织样本。核心技术包括：单细胞RNA测序（scRNA-seq）用于鉴定TNBC特异的NK细胞亚群；核质分离、核糖体图谱（Ribo-seq）和多聚核糖体分析验证UGDH-AS1的编码潜力；质谱分析和免疫共沉淀（Co-IP）筛选并证实NKSM与c-Myc的相互作用；染色质免疫共沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验验证转录因子（SMAD2/3/4, c-Myc）与靶基因（UGDH-AS1, TBX21）启动子的结合；构建条件性基因敲入（NKSM^+/+）和基因敲除（NKSM-KO）的小鼠模型及细胞系进行功能验证；流式细胞术（FACS）分析NK细胞功能分子表达；以及体外细胞毒性实验和体内荷瘤小鼠模型评估NK细胞的抗肿瘤效果。

ScRNA-seq分析鉴定出乳腺癌中TNBC特异性的UGDH-AS1⁺NK细胞亚群

通过对TNBC、HR+和HER2+乳腺癌患者的肿瘤浸润免疫细胞进行单细胞转录组测序分析，研究人员构建了乳腺癌免疫微环境图谱。他们特别关注了NK细胞，并将来自不同亚型的NK细胞数据进行整合聚类分析。结果发现，NK细胞可进一步分为五个亚群：DNAJB1⁺NK、GZMH⁺NK、IL17R⁺NK、ITGAE⁺NK和UGDH-AS1⁺NK。值得注意的是，UGDH-AS1⁺NK细胞亚群在TNBC患者中显著富集。进一步分析显示，与其它NK细胞亚群相比，UGDH-AS1⁺NK细胞表达更低的活化标志物（如CD16、CD161、CD107a）和细胞毒性分子（如GZMB、PRF1、IFN-γ），呈现功能抑制状态。生存分析表明，肿瘤组织中UGDH-AS1⁺NK细胞比例高的乳腺癌患者总生存期更短。这些结果提示UGDH-AS1⁺NK细胞与TNBC的发生、发展及不良预后密切相关。

UGDH-AS1通过编码微肽NKSM抑制NK细胞活性

为了探究UGDH-AS1的功能，研究人员在NK细胞系（NK-92MI）中过表达了UGDH-AS1。他们发现，过表达UGDH-AS1会降低NK细胞产生GZMB、PRF1、IFN-γ和CD107a的能力，并削弱其对TNBC细胞的杀伤作用。有趣的是，生物信息学分析和实验验证表明，UGDH-AS1并非传统的非编码RNA，其含有小的开放阅读框（sORF），能够与核糖体结合，具备编码微肽的潜力。通过构建带标签的表达载体、点突变实验以及制备特异性抗体，研究人员成功证实UGDH-AS1的sORF1能够编码一个由76个氨基酸组成的微肽，并将其命名为NKSM。该微肽在TNBC肿瘤浸润NK细胞中的表达水平显著高于其他乳腺癌亚型或外周血NK细胞。

NKSM抑制NK细胞抗肿瘤活性并促进TNBC肿瘤生长

为了区分UGDH-AS1的RNA转录本和其编码的NKSM微肽各自的功能，研究人员设计了一系列巧妙的体内外实验。在荷瘤小鼠模型中，注射过表达全长UGDH-AS1或仅过表达sORF1（即NKSM）的NK细胞，均能促进肿瘤生长。然而，当在过表达全长UGDH-AS1的细胞中敲低UGDH-AS1转录本后，其促瘤效应被逆转；而在仅过表达NKSM微肽的细胞中敲低UGDH-AS1转录本，则不影响其促瘤作用。这强有力地证明，UGDH-AS1对NK细胞功能的抑制作用是依赖于其编码的NKSM微肽，而非RNA本身。为了进一步验证NKSM在生理条件下的功能，研究人员构建了在NK细胞中特异性敲入NKSM基因的小鼠模型（NKSM^+/+）。结果显示，NKSM^+/+小鼠脾脏来源的NK细胞其IFN-γ、GZMB和PRF1的产生能力显著下降。在移植瘤模型和自发乳腺癌模型（MMTV-PyMT;NKSM^+/+）中，NKSM的表达均促进了肿瘤的生长和肺转移。而当使用抗体清除小鼠体内的NK细胞后，NKSM^+/+小鼠与对照小鼠在肿瘤生长和转移方面的差异消失，说明NKSM的促瘤效应确实是通过抑制NK细胞的功能实现的。

TGF-β信号通路促进UGDH-AS1⁺NK细胞形成和NKSM表达

接下来，研究人员探索了NKSM在TNBC NK细胞中高表达的上游调控机制。通过对UGDH-AS1启动子区域的分析，他们预测并验证了TGF-β信号通路的关键转录因子SMAD2/3/4的结合位点。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验证实SMAD2/3/4可以直接结合在UGDH-AS1的启动子上。双荧光素酶报告基因实验表明，SMAD4的过表达可增强UGDH-AS1启动子的活性，而敲低SMAD4或突变其结合位点则会消除TGF-β对UGDH-AS1转录的诱导作用。在细胞水平，TGF-β刺激能显著上调NKSM的表达，而使用SMAD3磷酸化抑制剂SIS3或SMAD4特异性小干扰RNA（siRNA）则能阻断这一效应。这些结果清晰地表明，肿瘤微环境中的TGF-β信号通路通过SMAD2/3/4转录复合物上调UGDH-AS1的转录，进而促进NKSM微肽的表达。

NKSM与c-Myc相互作用并降低其稳定性

为了阐明NKSM微肽抑制NK细胞功能的下游分子机制，研究人员利用免疫共沉淀联合质谱分析（Co-IP/MS）技术寻找与NKSM相互作用的蛋白质。他们惊喜地发现，癌蛋白c-Myc是NKSM的一个重要结合伙伴。后续的Co-IP实验在不同细胞中均证实了NKSM与c-Myc之间存在直接的物理相互作用。通过构建c-Myc蛋白的不同截短体，研究人员将NKSM的结合区域定位在c-Myc蛋白的N端1-144氨基酸区域内。值得注意的是，该区域包含一个关键的磷酸化位点——Ser62。已知ERK1/2激酶对c-Myc Ser62的磷酸化能够增强c-Myc的稳定性。实验结果显示，在过表达NKSM的细胞中，c-Myc蛋白的Ser62磷酸化水平及其总蛋白水平均显著下降。进一步机制探索表明，NKSM并不影响c-Myc另一个重要磷酸化位点Thr58的修饰。更重要的是，NKSM干扰了c-Myc与ERK1/2之间的结合，从而阻断了ERK1/2对c-Myc Ser62的磷酸化。当使用蛋白酶体抑制剂MG132阻止蛋白质降解时，NKSM仍然能抑制c-Myc Ser62的磷酸化，但不再引起c-Myc总蛋白水平的下降，说明NKSM是通过降低c-Myc的稳定性而非影响其合成来下调其蛋白水平的。环己酰亚胺（CHX）追踪实验直接证实，NKSM能够缩短c-Myc蛋白的半衰期。

NKSM通过下调c-Myc介导的T-bet表达调控NK细胞活性

c-Myc是细胞功能的重要调控者。那么，NKSM通过抑制c-Myc究竟影响了NK细胞中的哪些关键环节？研究人员将目光投向了转录因子T-bet（由TBX21基因编码），因为T-bet是NK细胞发育和功能的核心调控因子，能直接控制IFN-γ等效应细胞因子的表达。实验发现，在NKSM过表达的NK细胞中，T-bet的蛋白水平明显降低。生物信息学预测和c-Myc的ChIP-seq数据分析提示，c-Myc可能结合在T-bet基因的启动子区域。ChIP实验证实了c-Myc在T-bet启动子上的直接结合。双荧光素酶报告基因实验表明，NKSM过表达或c-Myc敲低均会抑制T-bet启动子的活性，而删除预测的c-Myc结合位点后，这种抑制效应消失。当同时敲低c-Myc和T-bet后，NKSM对NK细胞效应分子（IFN-γ, GZMB, PRF1）表达的抑制作用被消除。这些数据表明，NKSM通过抑制c-Myc的活性，进而下调其下游靶基因T-bet的转录，最终导致NK细胞功能分子的产生减少和细胞毒性功能受损。

NKSM作为TNBC免疫治疗的潜在靶点

基于上述发现，研究人员提出了一个潜在的免疫治疗新策略：通过靶向NKSM来逆转TNBC中NK细胞的功能抑制。他们构建了NKSM基因敲除（NKSM-KO）的NK-92MI细胞系。体外实验表明，在TGF-β存在或TNBC细胞条件培养基中，NKSM-KO的NK细胞对靶细胞（K562）的杀伤能力显著增强。在荷瘤小鼠模型中，输注NKSM-KO的NK细胞能够更有效地抑制肿瘤生长，并延长小鼠的生存期。此外，在人原代NK细胞中敲除NKSM也观察到了类似的增强抗肿瘤效果的趋势。这些结果验证了靶向NKSM在提高NK细胞免疫疗法疗效方面的应用潜力。

综上所述，这项研究深入揭示了TNBC肿瘤微环境调控NK细胞功能失调的一种新颖机制。研究人员发现了一个TNBC特异性的、高表达lncRNA UGDH-AS1的NK细胞亚群，并首次报道了UGDH-AS1编码一个具有重要免疫抑制功能的微肽NKSM。该微肽作为连接TGF-β信号通路和c-Myc癌蛋白的关键分子桥梁，通过干扰c-Myc的磷酸化和稳定性，进而抑制T-bet转录活性，最终导致NK细胞失能。这项研究不仅增进了我们对肿瘤免疫逃逸，特别是TNBC免疫抑制微环境形成机制的理解，更重要的是，它发现了NKSM这一全新的免疫治疗靶点。为开发针对TNBC的、基于NK细胞的新型免疫疗法（如采用CRISPR/Cas9技术敲除NKSM的CAR-NK细胞疗法）提供了重要的理论依据和实验证据，具有重要的科学意义和临床转化前景。