GM4951作为脂滴GTP酶调控肝脏脂质代谢的结构解析及其在MASLD中的作用机制

《Nature Communications》：Structural insights into GM4951 as a lipid droplet GTPase regulating hepatic lipid metabolism

本研究针对代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）中肝脏脂质异常积累的机制，聚焦于免疫相关GTP酶GM4951。研究人员通过X射线晶体学和冷冻电镜技术，首次解析了GM4951全长蛋白及其两种功能缺失突变体（N86K和D125G）的原子结构，揭示了其独特的尾对尾二聚体构象。研究发现GM4951通过N端螺旋结构域靶向脂滴（LD），其分子内二硫键对HSD17B13相互作用至关重要。该研究为理解GM4951在肝脏脂质代谢中的调控机制提供了结构基础，为MASLD治疗策略开发提供了新靶点。

　　

在当今社会，代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，原名非酒精性脂肪性肝病NAFLD）已成为全球最常见的慢性肝病之一。这种疾病最初表现为肝脏中脂质的异常堆积，就像一个仓库里货物只进不出，最终导致仓库爆满。正常情况下，肝脏能够通过复杂的代谢途径维持脂质平衡，但当这种平衡被打破，脂质就会在肝细胞内形成一个个"脂滴"（LD），长期积累便会引发肝炎、纤维化，甚至肝硬化。尽管科学家们已经知道一些与MASLD相关的基因和蛋白，但其中许多分子的具体工作机制仍是一个黑箱。

近年来，一个名为GM4951的蛋白引起了研究人员的注意。这种蛋白属于免疫相关GTP酶（IRG）家族，之前的研究发现，当小鼠缺乏Gm4951基因时，即使不肥胖，在高脂饮食后也会出现严重的肝脏脂肪变性。更有趣的是，GM4951能够定位到肝细胞的脂滴上，并与另一个与MASLD相关的蛋白HSD17B13相互作用。这些发现暗示GM4951可能是维持肝脏脂质平衡的关键分子，但它是如何工作的？它的结构有什么特点？为什么某些突变会导致它功能丧失？这些问题都亟待解答。

为了揭开GM4951的神秘面纱，由Rishi Raj、Yiao Jiang、Rahul Kumar Jha等研究人员组成的团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们采用了一系列先进的技术手段，包括X射线晶体学、冷冻电镜（cryo-EM）、分子动力学（MD）模拟和细胞生物学实验，对GM4951的结构和功能进行了全面解析。

研究人员首先通过分子克隆技术在大肠杆菌系统中表达了小鼠GM4951蛋白及其突变体，并利用镍柱亲和层析、分子筛层析和离子交换层析等多步纯化方法获得了高纯度的蛋白样品。他们通过X射线晶体学技术解析了GM4951与GTPγS（GTP的非水解类似物）和GDP结合状态的全长蛋白结构，以及两种与MASLD相关的错义突变体GM4951^Oily（N86K）和GM4951^{Carboniferous}（D125G）的晶体结构。为了研究GM4951在溶液中的真实构象，他们利用冷冻电镜技术解析了GM4951二聚体的高分辨率结构。此外，他们还通过分子动力学模拟分析了GM4951及其突变体中关键环区（switch-I和switch-II环）的动态行为。在功能研究方面，研究人员使用小鼠原代肝细胞模型，通过免疫荧光染色观察了GM4951及其各种突变体在脂滴上的定位情况，并通过免疫共沉淀实验验证了GM4951与HSD17B13的相互作用。

GM4951和突变蛋白GM4951^Oily和GM4951^{Carboniferous}在溶液中形成二聚体，不依赖于GTP或GDP

研究人员首先对纯化的野生型GM4951及其两种突变体进行了系统的生物物理表征。质量光度法分析显示，这三种蛋白在溶液中主要形成二聚体，仅存在少量单体。与之前报道的其他IRG蛋白不同，即使加入过量GTPγS或GDP（2000倍），GM4951的寡聚状态也未发生改变。热稳定性实验表明，GM4951^{Carboniferous}（D125G）的热稳定性最低（Tm为48.6°C），其次是GM4951^Oily（N86K，Tm为50.6°C），野生型GM4951最稳定（Tm为52.2°C）。值得注意的是，与GTPγS结合形式相比，GDP结合形式的GM4951总是表现出更高的热稳定性。

GM4951-GTPγS和GM4951-GDP复合物的整体结构

研究人员成功解析了GM4951-GTPγS（2.75 ?）和GM4951-GDP（2.51 ?）的晶体结构。GM4951（406个氨基酸）的结构包括两个主要部分：催化GTP酶结构域（残基68-262）和由N端（残基1-66）与C端（残基265-406）区域组成的螺旋结构域。GM4951的GTP酶结构域与其他小GTP酶一样，包含负责鸟嘌呤核苷酸结合的保守序列基序，以及响应GTP-GDP交换而发生重大构象变化的switch-I和switch-II区域。尽管GM4951的整体结构与之前解析的小鼠IIGP1、IRGB10和IRGB6结构相似，但其N端和C端区域的构象存在显著差异。

GM4951^{Carboniferous}（D125G）中GTP γ-磷酸的配位丧失

D125G（Carboniferous）突变是导致GM4951功能丧失的原因之一。结构分析发现，在野生型GM4951-GTPγS结构中，D125参与Mg²⁺的配位，有可能桥接与GTPγS的γ-磷酸的相互作用。而D125G突变影响了与γ-磷酸的相互作用，并可能减少了与Mg²⁺的配位，这在电子密度图中得到了证实（GDP结合的GM4951^{Carboniferous}结构中缺乏Mg²⁺的密度）。多重序列比对支持D125位点在协调Mg²⁺（对GTP酶活性至关重要）方面的高度保守性。因此，D125G突变的主要影响是损害GTP的β-和γ-磷酸之间磷酸二酯键的水解。

GM4951^Oily（N86K）中switch-I环的动态/运动改变

对N86K（Oily）突变体的结构分析揭示了其功能丧失的结构基础。在野生型GM4951中，N86通过与H93、R89、S82和A98等残基形成氢键网络，稳定并调节对催化活性至关重要的调控性switch-I环和P-loop的运动。而在GM4951^Oily中，N86K的取代引入了一个带正电荷且侧链更长的氨基酸，破坏了原有的相互作用网络，导致相邻的switch-I环偏离其自然位置，改变了环的运动或动力学，最终影响了蛋白质的催化活性。

分子动力学模拟提示switch-I和switch-II环的动态特性

为了分析GM4951关键环的结构动力学以及D125G和N86K突变的影响，研究人员进行了全原子分子动力学模拟。模拟结果显示，与野生型GM4951相比，GM4951^{Carboniferous}的switch-I和switch-II环波动性更大，而GM4951^Oily则主要在switch-I环上表现出更多变异。这些结果与结构研究一致，支持了GM4951变体中switch-I和/或switch-II环的灵活性增加。

GM4951脂滴定位依赖于其N端区域

为了解GM4951特异性靶向脂滴的结构特征，研究人员聚焦于其N端和C端。尽管GM4951的N端（残基1-50）与IIGP1有52%的序列同一性，但两者的构象存在明显差异。功能实验表明，删除GM4951的N端50个氨基酸、将其与IIGP1的N端50个氨基酸交换、或突变豆蔻酰化 motif（G2A）都会完全破坏GM4951向脂滴的转运。这表明GM4951的N端螺旋、保守的豆蔻酰化位点以及GTP酶活性对其脂滴定位至关重要。

GM4951中的分子内二硫键

GM4951的晶体结构揭示了一个介于C235和C403之间的分子内二硫键。尽管这两个半胱氨酸在IIGP1的对应位置也存在，但该二硫键在IIGP1结构中并未被解析。功能实验显示，破坏二硫键（C235A突变）并不影响GM4951的寡聚状态及其向脂滴的定位，但几乎完全废除了GM4951与HSD17B13的相互作用。这表明该二硫键在介导GM4951-HSD17B13相互作用中扮演着特定角色。

GM4951在溶液中形成二聚体，但方式如何？

质量光度法显示GM4951在溶液中主要是二聚体。尽管在晶体结构中观察到了多种可能的二聚体界面，但针对推测的"头对头"界面（类似于其他IRG蛋白）的突变并未显著破坏二聚体形成。因此，研究人员利用单颗粒冷冻电镜解析了GM4951的高分辨率（3.03 ?）结构，揭示了一种在结构同源蛋白中前所未见的"尾对尾"二聚体排列方式。

尾对尾二聚体界面

冷冻电镜结构显示，GM4951的二聚体界面由两个原体的螺旋结构域形成，呈尾对尾排列。该界面包含疏水相互作用、静电相互作用和氢键，埋藏面积达1181 ?2。为了验证该界面的生理相关性，研究人员构建了针对界面关键残基的突变体（如I50R、Q51Y、S292K等）。分子筛层析和质量光度法分析表明，这些突变体均显示出从二聚体向单体的明显转变，证实了这些残基在稳定GM4951二聚体架构中的关键作用。

尾对尾界面突变体的寡聚界面分析

对一系列尾对尾二聚体界面突变体的分析进一步证实了该界面的重要性。例如，GM4951^I50R_Q51Y双突变体几乎将蛋白质完全转变为单体（约95%）。同样，GM4951^S292K、GM4951^S292K_F293K和GM4951^{S292K_F293K_F294A}也显示出向单体物种的转变。这些观察结果强有力地支持了这些残基在稳定GM4951二聚体形式中的关键作用。

重要的是，二聚化的破坏损害了GM4951在脂滴上的定位。由于脂滴靶向是GM4951在肝脏脂质代谢中发挥作用所必需的，这些发现确立了二聚体形成是该蛋白质生物学功能的结构前提。

讨论

本研究通过综合运用生物物理和结构生物学方法，深入揭示了GM4951调控肝脏脂质代谢的分子机制。研究人员不仅解析了野生型GM4951及其功能缺失突变体的精细三维结构，还通过巧妙的突变设计和功能验证，阐明了其独特的二聚化模式、脂滴靶向机制以及与相互作用蛋白HSD17B13的关联。

研究发现，GM4951与同家族蛋白IIGP1、IRGB6和IRGB10虽然整体结构相似，但在N端和C端螺旋结构域的局部构象、二聚化方式以及功能上存在显著差异。GM4951采用独特的尾对尾二聚化方式，这与之前报道的同源蛋白的头对头二聚化截然不同。其脂滴定位依赖于N端区域、保守的豆蔻酰化位点以及完整的GTP酶活性。尤为重要的是，分子内二硫键（C235-C403）虽然不影响蛋白的寡聚状态和脂滴定位，但对GM4951与MASLD相关蛋白HSD17B13的相互作用至关重要。

该研究的另一重要发现是揭示了N86K和D125G突变导致GM4951功能丧失的结构基础。N86K突变通过破坏P-loop和switch-I环之间的氢键网络，改变了switch-I环的动态特性；而D125G突变则直接影响了Mg²⁺的配位，进而损害了GTP的水解能力。分子动力学模拟结果为这些结构观察提供了动态证据，显示突变体蛋白中switch环的波动性增加。

从进化角度看，GM4951及其小鼠同源物形成一个独立的进化枝，与Ras家族的其他GTP酶明显分开。人类中只有两个IRG基因（IRGM和IRGC），它们与GM4951的序列同一性较低。人类IRGM变异与MASLD相关，而IRGC也能下调原代人肝细胞中的甘油三酯水平。因此，本研究为理解人类IRG蛋白是否以及如何执行与GM4951相似的功能提供了重要的参考框架。

综上所述，这项研究首次在原子水平上揭示了GM4951的结构特征及其在肝脏脂质代谢中的调控机制，为理解MASLD的发病机制提供了新的结构见解，也为未来开发针对该疾病的新治疗策略奠定了坚实的理论基础。